响应面法优化木豆叶总黄酮酶提取工艺

响应面法优化木豆叶总黄酮酶提取工艺

木豆是科可可豆科生物。它分布在东南亚、印度、中国西南部和海南其他省份。木豆叶药用价值很高,可用于治疗外伤、烧伤、褥疮[2~3]、肝炎、结石、黄疸、小儿水痘和糖尿病等症[4~5]。木豆叶的主要活性成分为黄酮类和芪类化合物,其中黄酮类化合物主要包括牡荆苷、异牡荆苷、球松素、芹菜素等。研究证实木豆叶黄酮类成分具有抗菌、抗肿瘤、抗氧化、抗病毒、镇定、解痉、治疗股骨头坏死等多种药理活性[7~11]。目前木豆中总黄酮的提取主要有冷浸提取、超声提取、热回流提取、微波提取等传统方法。酶法提取天然产物中的活性成分较其他方法具有耗能低、反应条件温和、提取时间短等优点,近年来酶法提取作为一种新兴技术广泛用于植物有效成分的提取分离。但迄今为止尚未见酶法提取木豆叶总黄酮的研究报道,本研究中笔者拟采用纤维素酶辅助提取木豆叶总黄酮,以期为木豆叶总黄酮的开发利用提供实验依据。1仪器和试剂盒1.1紫外分光光度计WK891烘干箱,河北黄骅生产;AB104型电子天平,瑞士生产;紫外分光光度计,瑞典PharmaciaBiotech公司生产;KQ-250DB型数控超声波清洗器,昆山市超声仪器有限公司生产;水浴锅。1.2药物检定所需的药品及制剂木豆叶药材由浙江海正药业股份有限公司提供;芦丁标准品(质量分数≥97%,批号1000802-200829)购于中国药品生物制品检定所;纤维素酶(400U·mg-1)购于上海维编有限公司;95%乙醇;硝酸铝;氢氧化钠;亚硝酸钠;无水甲醇等均为分析纯。2方法和结果2.1不同浓度alno33溶液参照吕欣等测定总黄酮的方法,精确称取恒重干燥的芦丁对照品5mg,用无水乙醇溶解,摇匀,定容至5mL,配成浓度为1mg·mL-1的芦丁标准品贮备液。精密量取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL贮备液,分别加水至3mL,加5%NaNO2水溶液0.5mL,静置6min,10%Al(NO3)3溶液0.5mL,放置6min,加5%NaOH溶液2.5mL,混匀静置15min,以蒸馏水定容至10mL。测定500nm处吸光度,以吸收度Y为纵坐标,浓度X为横坐标,进行线性回归,得到回归方程Y=0.0103X+0.0446,相关系数R2=0.9997。2.2纤维素酶活性提取准确称取木豆叶干粉1.0g置于容积100mL三角瓶,加入20倍量的纤维素酶水溶液,在设定温度下水浴提取一定时间后再加入乙醇,调节乙醇浓度为80%,醇提1h,过滤,滤渣以同样条件再提取2次,过滤、合并滤液,然后定容至100mL容量瓶中。用“2.1”项下方法测定提取液中总黄酮含量:2.3单因素试验和响应面法试验根据Box-Behnken中心组合设计原理,结合单因素实验结果,选择酶用量、酶解温度、酶解时间和酶解pH值4个因素,在单因素试验基础上采用4因素3水平响应面分析方法确定总黄酮的最佳提取条件。试验因素与水平设计见表1。3结果与分析3.1酶解时间和ph值对总黄酮得率的影响加酶量在0.25~16mg时对总黄酮得率的影响趋势为,随着酶量增加,总黄酮得率增大,当加酶量达8mg时总黄酮得率达到最高,酶量大于8mg时,随酶量增加总黄酮得率反而减弱,可能是过量的纤维素酶与木豆叶组织结构中纤维素底物之间的吸附作用达到饱和,抑制了活性成分的传质与释放,本实验适宜加酶量范围为6~10mg。酶解时间在0.5~4h时对总黄酮得率的影响趋势为,酶解时间在0.5~2.0h时,随酶解时间延长总黄酮得率逐渐增大,酶解时间达到2.0h时,总黄酮得率最高,而酶解时间在2.0~4.0h时,随酶解时间的延长,总黄酮得率则呈降低趋势,其适宜酶解时间为1.5~2.5h。酶解pH值在3.5~6范围内对总黄酮得率的影响如下,pH值由3.5增加到4.5时,总黄酮得率变化不明显,而pH值在4.5~5.0时,总黄酮得率增加较快,pH值达到5.0时总黄酮得率最高,pH值超过5.0后,总黄酮得率逐渐下降,其适宜pH范围为4.5~5.5。酶解温度在25~50℃对总黄酮得率影响的影响如下,随着酶解温度的升高,总黄酮得率也逐渐增大,当温度达到35℃时总黄酮得率最高,而后逐渐下降,其适宜温度范围为30~40℃。3.2回归方程拟合及方差分析结果根据单因素试验结果,采用Box-Behnken设计,以酶用量(A)、酶解温度(B)、酶解时间(C)和酶解pH(D)为自变量,总黄酮得率(Y)为响应值,进行响应面分析,试验结果见表2,方差分析及回归系数显著性检验结果见表3。采用Design-expert8.0软件对表2中数据进行多项式拟合回归,建立多元二次响应面回归模型:Y=-51.94046+0.43100A+6.15285B+12.46287C+1.02842D+0.36356AB+0.032633AC-9.87055E-004AD-0.32160BC-0.063091BD+7.70998E-003CD-0.074872A2-1.37289B2-1.22994C2-0.013742D2根据方差分析结果可知,二次方程模型极显著(p<0.01),模型决定系数R2为0.9647,表明超过96%的实验数据可用该模型进行解释,说明方程可靠性较高,失拟项F值为5.54,p值为0.0567,表明失拟项不显著,模型拟合良好。加酶量、提取时间、提取温度达极显著水平(p<0.01),二次项A2、B2、C2、D2影响极显著(p<0.01)。根据回归方程作出各因素交互作用响应曲面如图1所示,各因素对总黄酮得率的影响不是简单的线性关系,可看出加酶量和提取时间交互影响显著,表现为曲线图陡峭,其他因素曲线较平滑。由Box-Behnken设计优化得到总黄酮最佳提取工艺条件为:酶用量8.65mg,酶解温度33.88℃,酶解时间2.02h,酶解pH为5.02,预测总黄酮理论得率为4.86%。3.3最佳工艺条件的验证在上述最优条件下实际进行3次提取试验,得到木豆叶总黄酮得率为4.88%(RSD=0.6%),与预测值4.86%吻合良好,实验误差小,充分验证明响应面法优化纤维素酶辅助提取木豆叶总黄酮工艺条件稳定可靠,可用于实际预测。4木豆叶总黄酮提取工艺(1)响应面分析法是采用多元二次回归的方法,研究几种因素间交互作用的回归分析方法,能够以最经济的方式对实验因素进行全面分析和研究,广泛应用于生物、医药、化工、食品等领域。中草药的细胞壁由纤维素构成,其中的有效成分常包裹在细胞壁内。纤维素是葡萄糖以β-D-葡萄糖以l,4-β葡糖苷键连结,用纤维素酶解可破坏β-D-葡萄糖键,进而有利于有效成分的提取。本文首次采用纤维素酶解与醇提相结合的提取工艺,首先使用酶水溶液破坏植物细胞壁,使总黄酮最大限度的溶出,在酶辅助提取基础上使用乙醇继续提取,不仅提高了总黄酮的提取效率而且还减少了溶剂的使用