超声提取木豆叶总黄酮的工艺研究

超声提取木豆叶总黄酮的工艺研究

木豆cajanuscajun（l.）misspaugh是一项多年生灌木植物，是迄今为止唯一的未经处理的木本植物。木豆广泛分布于热带和亚热带地区,具有耐旱、耐寒、耐瘠、生长快、易繁殖等特点,在我国主要分布于云南、四川、江苏、福建、广东、台湾等省。在我国民间用木豆治疗外伤、烧伤感染和褥疮等,还可用于镇痛、肝炎、结石、黄疸、小儿水痘和糖尿病等症,且其消炎止痛功效优于水杨酸。用木豆叶治疗股骨头坏死取得了很好的疗效,在现代医药中以木豆叶为单味药的通络生骨胶囊具有活血祛瘀,通络生骨的功效,已在临床应用20多年。药理学调查显示木豆叶中有效活性成分主要是黄酮类和芪类化合物等。黄酮类化合物广泛存在于植物的各个部位,尤其是花叶部位。木豆叶中黄酮类化合物种类繁多,因此总黄酮含量成为木豆叶药用质量的重要指标。近年来,由于木豆叶优异的药用价值,学者们对其展开了许多研究。关于木豆叶总黄酮含量方面的研究较少。赵恩泽对木豆叶总黄酮测定方法进行比较研究,确定了硝酸铝比色法为木豆叶总黄酮的最佳测定方法,测得木豆叶黄酮含量为15.65mg·g-1。刘中秋等以牡荆苷为对照品,用硝酸铝比色法测定木豆叶总黄酮的含量为0.86mg·g-1。超声波提取活性物质是目前应用较为广泛的提取技术,利用超声波辐射产生的机械粉碎作用和空化效应增大物质分子运动频率和速度加速植物细胞壁破裂,以利于物料中活性成分转移,并充分溶于溶剂中。侯春莲在木豆叶牡荆苷与异牡荆苷提取纯化工艺及其抗菌活性的研究中,比较了超声提取法,浸渍法,热回流法,索氏提取法的提取效率,其中超声提取法效果最佳。本试验采用超声提取木豆叶中的总黄酮,研究超声提取工艺参数,旨在建立木豆叶超声提取工艺,为提高木豆叶总黄酮得率提供参考依据。1材料和方法1.1试剂及试剂原料:木豆叶,采自福建省农业科学院作物研究所福州试验基地。试剂:芦丁标准品,购自中国食品药品检定研究院;乙醇、NaNO2、NaOH等试剂均为分析纯,购自国药集团化学试剂有限公司;Al(NO3)3为分析纯,购自天津市永大化学试剂有限公司。1.2仪器和检测设备紫外可见分光光度计:T6新世纪(北京普析通用仪器有限责任公司),SB-5200DTDN超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司),高速冷冻离心机:Centrifuge5804R(eppendorf公司),超纯水系统:arium611DI(Sartoriousstedim公司),电子天平:DenverTP-214(丹佛仪器有限公司),电热鼓风干燥箱:DHG-9240A(上海一恒科学仪器有限公司)。1.3测试方法1.3.1l离心提取将采摘的木豆叶样品于60℃烘干,粉碎,过80目筛网。称取一定量的样品粉末于10mL离心管中,按一定比例加入一定浓度乙醇,在30℃下超声提取,在10000r·min-1下离心5min,移取一定量离心后的上层提取液于5mL容量瓶,按照显色方法显色,加与提取相同浓度乙醇溶液定容,于最大波长510nm处测定吸光值,计算含量。1.3.2黄酮与铝盐络合物络合物的稳定性测定方法原理:样品中总黄酮的含量以芦丁为对照品测定,加入铝离子试剂,同时控制适宜pH值,使黄酮化合物与铝盐形成络合物,在可见光区能获得稳定的特征吸收峰。标准储备液的配制:精密称定干燥至恒重的芦丁对照品0.0252g于100mL容量瓶中,用乙醇定容,摇匀,制备成0.252mg·mL-1的标准品储备液。1.3.3硝酸盐溶液配制精密移取0.2mL样品溶液至5mL(具塞刻度)试管中,加5%亚硝酸钠溶液0.3mL,摇匀,静置6min后,加10%硝酸铝0.3mL,摇匀,静置6min。再加入4%氢氧化钠溶液2mL,摇匀,静置10min,定容,即可。1.3.5含量测定方法。作为检测对象,其测定黄酮类物质为精密称取0.1g木豆叶粉末,按照一定的料液比加入一定浓度的乙醇超声提取,精确移取提取液0.2mL,按照2.3项显色,在510nm处测定吸光值,并计算含量。算式:W=(C×V×n)×100%/(m×106),其中:W为样品中黄酮类物质得率/%;C为待测液黄酮类物质质量浓度/(μg·mL-1);V为待测液体积/mL;n为稀释倍数;m为木豆叶质量/g。2结果与分析2.1采用单因素黄酮法提取木豆叶，进行试验分析2.1.1乙醇浓度对木豆叶黄酮得率的影响称取0.1g木豆叶粉末,按照1∶20的料液比分别加入50%、60%、70%、80%、90%的乙醇,超声提取20min,分别测定不同乙醇浓度下的木豆叶总黄酮的得率,结果见图2。由图2可知,随着乙醇浓度的增加黄酮得率先增大后减小,在乙醇浓度达到70%时,木豆叶的总黄酮得率达到最大值。不同浓度的乙醇极性不同,根据相似相溶原理,不同浓度的乙醇对物质的提取存在影响。提高乙醇浓度可以增大提取剂对木豆叶的渗透性,从而促进了黄酮类物质的溶解,提高总黄酮得率;当乙醇浓度超过一定比例时,黄酮得率开始下降。对乙醇浓度进行单因素方差分析,5个处理间存在极显著差异(F0.01=7.01,F=24.23**)。对5个处理进行多重比较(如表1)可知,处理间存在极显著差异。超声提取的最适乙醇浓度为70%。2.1.2总黄酮含量的测定称取0.1g木豆叶粉末,按照1∶20的料液比加70%的乙醇,分别超声提取10、20、30、40、50min,分别测定不同超声提取时间下的木豆叶总黄酮的得率(图3)。由图3可知,随着超声时间的延长,黄酮得率增加,超声波空化和震荡作用有利于细胞内物质的溶出,当处理时间达到20min时,从木豆叶中提取的黄酮类化合物得率达到最大值,随着超声提取时间继续延长,黄酮得率反而降低。从单因素方差分析表中可知,在10~50min的时间范围内,超声时间对总黄酮的提取无显著性影响。考虑到生产周期、设备损耗和提取效率问题,提取时间以20min为宜。2.1.3黄酮类化合物的得率称取0.1g木豆叶粉末,分别按1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50的料液比加入70%的乙醇,超声提取20min,分别测定不同料液比下提取木豆叶黄酮类化合物的得率,结果见图4。由图4可知,随着料液比的增加,黄酮类物质的得率先增大后减小,在料液比为1:30时黄酮类物质的得率达到最大。经方差分析,料液比对总黄酮的提取有极显著的影响(F0.01=7.01,F=43.48**),对不同料液比处理进行多重比较,料液比1∶20到1∶50之间总黄酮的得率无显著差异,而均极显著高于料液比1∶10。从提取效果和溶剂使用量综合考虑,提取木豆叶黄酮类物质的料液比可适当降低,选择1∶20~1∶30为宜。2.2正交试验2.2.1提取条件对木豆叶总黄酮得率的影响在单因素试验的基础上,确定以木豆叶总黄酮得率为指标,综合考察超声时间(A)、乙醇浓度(B)、料液比(C)3个因素的3个水平,进行L9(34)正交试验,探讨不同提取条件及其条件间的相互作用对木豆叶总黄酮得率的影响。设计试验因素水平表(表2)。2.2.2乙醇浓度序bb由表3正交极差分析可知,影响木豆叶总黄酮得率的主次顺序为:B>C>A,即乙醇浓度>料液比>超声时间。超声提取木豆叶总黄酮的最佳工艺条件为:A2B2C2,即超声时间20min,乙醇浓度70%,料液比为1∶30。2.4总黄酮含量测定按照最佳条件进行3次重复试验,即称取0.1g木豆叶样品,按照1∶30的料液比加70%的乙醇,超声提取20min,测定木豆叶片中总黄酮的含量(表4)。由表4可知,在最佳条件下3次提取木豆叶的总黄酮的平均含量为3.65%,结果与单因素试验中优选结果一致,表明该优选工艺稳定可行。2.5检测方法的重复性按照最佳条件下,提取木豆叶中的黄酮类物质,显色,在510nm处测定吸光值,重复6次,其方法重复性的RSD为0.754%,表明重复性好(表5)。2.6h内稳定性测定精密量取供试溶液,按照显色体系反应完全后,每隔15min记录1次吸光值,连续测定2h,计算RSD值为3.360%,说明2h内稳定性良好(表6)。2.7回收率和误差在已知黄酮含量的3份供试溶液中加入适量标准品溶液,显色,测定吸光值,计算其回收率为99.01%~102.72%,平均回收率为100.80%,试验过程中存在误差,包括操作中的偶然误差和仪器造成的系统误差,本试验数据的回收率值于可接受范围。RSD为1.84%(表7),说明该方法测定的结果准确可靠。3最佳工艺确定的结果本研究以木豆叶为原料,采用超声方法提取样品中的黄酮类物质,用紫外-可见分光光度法测定其总黄酮的含量。通过单因素和正交试验讨论不同提取条件对总黄酮提取率的影响,确定木豆叶总黄酮提取的最佳工艺为:超声时间20min,乙醇浓度70%,料液比为1∶30。按照最佳工艺提取木豆叶总黄酮,其得率达到3.65%。通过对方法稳定性,重现性,回收率的考察,确定该方法测定结果准确可靠。采用超声波法提取木豆叶黄酮类物质,操作方便,省时高效,该研究的结果对改进提取工艺以提高木豆叶黄酮类物质得率具有一定的参考性。乙醇浓度和料液比对木豆叶黄酮得率有极显著性影响,若采用超声提取木豆叶总黄酮,需要控制好乙醇浓度和料液比,由于超声时间对木豆叶黄酮的提取无显著性差异,因此在实际生产中,可以选择合适的超声时间以减少能耗,提高效率,从而降低提取成本。1.3.4标准曲线的绘制分别精密量取对照品溶液0、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8mL按