微波提取-压力气氛灭菌法测定水中稀碱水的研究

微波提取-压力气氛灭菌法测定水中稀碱水的研究

著名的野生茶，如甜茶、眉毛茶、白茶、龙舌茶和清溪草。属于葡萄园科蛇葡萄属的显齿蛇葡萄园，属于野生藤本植物。藤茶中含有多种化学成分,包括水分、蛋白质、维生素、多酚和黄酮等,其中黄酮类化合物具有最重要的药理作用。而二氢杨梅素是其中最重要的黄酮类化合物。二氢杨梅素(Dihydromyricetin,简称DYM)具有黄酮化合物的基本结构,且C环2位和3位碳原子上具H原子,没有双键,故在分类上属于黄酮中的二氢黄酮类化合物。该化合物的化学结构式见图1。二氢杨梅素具有降血糖、降血脂、保肝、抗炎、抗氧化、镇痛和止咳等药理作用。所以,二氢杨梅素在食品、保健品以及医药方面有重大的研究前途。本文结合大量的文献,利用微波装置和食品高温高压灭菌装置的结合,用可见分光光度法的测定,来探讨藤茶二氢杨梅素新的提取工艺。进一步提高和简化藤茶二氢杨梅素的提取,利用正交实验优化最佳的提取条件。1材料和方法1.1实验材料1.1.1乙醇、试剂和仪器藤茶叶:芳村茶叶市场;pH9~10的NaOH碱水:自制;95%乙醇:分析纯,天津市富宇精细化工有限公司;无水AlCl3:分析纯,广东台山粤侨试剂塑料有限公司;蒸馏水:广州大学实验室自制;二氢杨梅素纯品:广东省果蔬深加工重点实验室制。1.2实验方法1.2.1稀碱水+转子水准确称取1g经过20目的分子筛的藤茶叶,于微波装置反应胶罐中,加入稀碱水,转子。将反应胶罐于微波装置中进行微波提取,提取完后,将反应胶罐中的藤茶叶及液体全部转移到小烧杯中,封上保险纸,于高温高压装置中提取,一定时间及温度后,趁热过滤,滤液待测。1.2.2空白液的制备将趁热抽滤的提取液于大试管中,抽取0.1mL于10mL的容量瓶中,用95%的乙醇定容到刻度,摇匀,抽取1mL于另外的10mL容量瓶中,加入3mL的AlCl3,用95%的乙醇定容到刻度,同时做空白液。在室温下放置40min,于分光光度计中测定。2标准曲线的绘制2.1紫外分光光度的测定称取微量的二氢杨梅素纯品,用95%分析纯乙醇溶解并定容至刻度,摇匀。抽取1mL于10mL容量瓶中,精确加入5%AlCl3溶液3mL,95%乙醇定容至刻度,在室温下放置40min,于紫外分光光度仪UV-2450中扫描,见图2。从纯品的扫描图图2可知,最大的吸收波长是205.80nm。但205.80nm和309.80nm是紫外区,没有377nm的可见光区操作方便。而且从图3中可看到,提取液的测定扫描曲线和二氢杨梅素纯品的扫描曲线十分相似,都在波长377nm附近有较稳定的吸收。故取吸收峰377nm的2/3,即404nm作为测定吸光度的波长。图3中由上而下(甲、乙、丙)分别是不同条件下二氢杨梅素提取液(甲、乙)及纯品二氢杨梅素(丙)的测定扫描图。2.2容量瓶测定方法精确称取二氢杨梅素纯品10.50mg,用95%分析纯乙醇溶解,于10mL容量瓶中定容至刻度,摇匀。分别精确地移取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL于10mL容量瓶中,按1.2.2的测定方法,于404nm处测定。结果见表1和图4。从标准曲线图得到的回归方程为:A=6.42x+0.0156,R2=0.9998(n=5)。2.3总黄酮提取率计算公式将抽滤液按照1.2.2的测定方法,测定其提取液的吸光度,其提取率的计算公式为:式中:A为提取液的吸光度;K为二氢杨梅素在总黄酮中所占的质量分数,K=0.86。把K=0.86,P=1000代进公式后,简化为:3微波条件优化本实验影响藤茶二氢杨梅素因素主要有溶剂的pH值、高温高压的时间、料液比、微波萃取温度、微波萃取时间、微波装置的功率、转子转速等因素的影响,分别进行单因素的实验,以选择较好的水平,用正交实验来优化最佳提取条件。3.1ph值对提取率的影响由于二氢杨梅素具有多个羟基官能团,等电点偏酸性,所以溶剂的pH值对提取过程有一定的影响。准确称取1g藤茶,料液比为1∶25,微波温度为95℃,微波时间为5min,微波功率为600W,高温高压时间为15min,pH值对提取率的影响结果见表2和图5。由图5可知,稀碱水的提取率最高,宜采用碱性溶剂提取。一般碱水提取时提取率可提高1%~2%或更多,同时还易于保存;但碱性不能太强,强碱在加热条件下会破坏黄酮化合物的母核以及损坏提取容器设备。3.2料液比的确定二氢杨梅素是一个极性化合物,水是一种很好的提取剂。不同的料液比对二氢杨梅素影响较大,因为二氢杨梅素从藤茶中提取出来,水量的多少直接影响其溶解量。料液比对提取率的影响结果见表3和图6。随着溶剂量的增多,二氢杨梅素的提取率也相继增大,但从图6中可以看到,料液比为1∶25以后,藤茶二氢杨梅素的提取率增加幅度很少,水量的增多还会造成二氢杨梅素的纯化的时间增长,纯化率降低。所以从图6中选择料液比1∶15~1∶25为正交实验的水平范围。3.3微波加热加热近年来发展起来的微波辅助提取技术,具有提取时间短和提取效率高等优点。微波加热的原理是利用被加热物质的极性分子(如H2O)在微波电磁场中快速转向及定向排列,从而产生撕裂和相互摩擦而发热。微波加热是能量直接作用于被加热物质,其模式为:热源-样品-器皿。微波作用可以有效地将茶叶的细胞壁及结构破坏,使有效成分易于从细胞中释放出来,但难于扩散到溶剂中,所以本实验把微波加热作为一种辅助手段,高温高压提取把细胞已经被破坏了的茶叶中的二氢杨梅素较好地溶于溶剂中,从而对提高提取率有很大的帮助。3.3.1微波温度对二氢杨树牢干制备二氢虾考虑到二氢杨梅素在热水中的溶解度较高,但提取温度不能超过100℃,否则其他黄酮类会被提取出来,影响测定结果。微波温度对提取率的影响见表4和图7。从图7可知,微波温度对二氢杨梅素的提取影响较大,是一个重要的影响因素,温度低于70℃时,提取率非常低,提取率不超过10%。随着温度的提高,提取率也相对的提高,但是提取温度不能超过100℃,因为提取温度在100℃以上时候,其他的黄酮类化合物会被提取出来,影响测定结果,所以在本实验中微波温度在95℃时提取效果最佳。所以选择温度75~95℃为正交实验的水平范围。3.3.2微波保持时间对二氢杨树莓原螯虾提取率的影响微波时间主要是指,在一定的微波温度下,微波加热所保持的时间。按照1.2.1提取方法和1.2.2测定方法,微波时间对提取率的影响结果见表5和图7。从表5和图7可以看到,微波的保持时间对二氢杨梅素的提取有一定的影响,但影响不大。随着微波时间的延长,其提取率也相继增大,但增大的幅度很少。主要原因可能是微波把茶叶的细胞结构破坏,黄酮类化合物被释放而附在茶叶表面。在微波装置中,随着微波保持时间的延长,藤茶中黄酮类化合物并没有溶于溶剂中,所以微波作用只是起到了破坏茶叶细胞的作用,微波保持时间延长对二氢杨梅素的提取影响较小。所以选择微波时间1~5min为正交实验的范围。3.4提取温度和工气压力目前高压技术的研究多用于食品的灭菌保存方面,高压技术还可用于微生物细胞破碎,以有效提高细胞内物质的提取效率。经高压处理后,提取效率明显提高。但由于高压设备要求比较高,所以采用食品研究中的仪器———压力蒸气灭菌器。一定的压力有助于被微波破坏细胞结构的藤茶中的黄酮类化合物溶于溶剂中,从而提高提取率。经实验证实,设置仪器温度为105℃,高压15min和45min后,提取液的温度为78~94℃,提取液的提取温度没有超过100℃。105℃下其蒸气压力为0.5个大气压。考查不同的高温高压时间对提取过程的影响,其实验步骤为:设置压力蒸气灭菌器的温度为105℃,分别在高温高压时间5、15、30、45、60min条件下,对按照1.2.1提取方法得到的提取液进行处理,按1.2.2测定方法测定,结果见表6和图8。从表6和图8可以看到,二氢杨梅素的提取随着高温高压时间的延续,其提取率相继增加,但30min后,二氢杨梅素提取率增大幅度减少,原因可能是二氢杨梅素的提取已达到了饱和,随着时间的延长,其他杂质也相继提取出来,例如:30min的提取液是黄色的,但60min的提取液是绿色的,初步认为是色素、咖啡碱、甘宁等杂质的溶出,使提取液的颜色变深。从图8可以看到,经高温高压提取后,其曲线与没有经过高温高压处理的标准曲线在形状上几乎一样,所以,高温高压提取没有造成二氢杨梅素结构的破坏。高温高压对整个提取过程影响较大的,从表4的第5组数据可知,没有经过高温高压提取时,其提取率为20.5%,然后经过高温高压提取,其数据见表6可知,提取率增大1%~6%。3.5提取过程的工况和转速微波功率主要的作用体现在溶剂的提温速度和加热时间上,功率越大,提温速度越快,而且它还对茶叶细胞的结构破坏有一定的影响。本实验选择功率300~600W为正交实验的水平范围。转子转速是在提取过程中,转子起到搅拌的快慢作用。它只在微波装置起搅拌作用。从低速到高速为正交实验的水平范围。4正交实验优化最佳提取条件4.1压力蒸气灭菌器的正交分析本实验是以藤茶二氢杨梅素的提取率为单指标的。影响二氢杨梅素的提取率主要有两大部分:微波装置和压力蒸气灭菌器。微波装置的因素包括:料液比、微波温度、微波保持时间、微波功率和转子转速。压力蒸气灭菌器的主要因素是高温高压处理时间。则本实验采用6因素3水平的正交方式来进行正交实验。从以上讨论的单因素对二氢杨梅素提取率的影响来确定每个因素的水平。选择的料液比水平为:1∶15、1∶20、1∶25;微波温度水平75、85、95℃;微波保持时间1、3、5min;微波功率300、500、600W;转子转速:低速、中速、高速;高温高压提取时间(105℃)15、30、45min。4.2微波最佳提取条件的确定选用正交表L18(3)7,其6因素3水平的相互作用的结果见表8和图9。从正交实验表的数据(表9)可知,影响二氢杨梅素的提取率的因素顺序为1>2>3>5>6>4,即高温高压时间影响最大,接着是料液比>微波时间>转子转速>微波保持时间。从效应曲线图7可知,最佳的提取条件为高温高压时间45min、料液比1∶25、微波温度95℃、微波时间5min、微波功率500W、转子高速。重做实验18和正交最佳的提取条件,其结果见表9。从表9的实验结果可知,正交最佳的提取条件的提取率为30.94%最高,所以本实验的最佳条件为高温高压时间45min、料液比1∶25、微波温度95℃、微波时间5min、微波功率500W、转子高速。5最佳提取条件的确定本实验由二氢杨梅素的提取到测定过程,连贯性较强,需要连续完成。因为二氢杨梅素在冷水中溶解度很小,热的二氢杨梅素滤液在室温中放置一段时间后,因溶剂的降温,二氢杨梅素会从溶剂中析出,影响测定的操作和结果。藤茶中二氢杨梅素的提取,温度是关键。提取的温度但不能超过100℃,否则其他黄酮类化合物被提取出来,影响测定结果。而且,提取液应高温抽滤,避免二氢杨梅素从溶剂中析出。本实验的测定方法是吸光度法。Al3+与二氢杨梅素络合显亮黄色。但是放置时间对测定结果影响较大,放置时间以40min为宜。经过单因素和正交实验,确定了最佳提取条件为高温高压时间45min,料液比1∶25,微波温度95℃,微波时间5min,微波功率500W,转子高速