紫苏FAD3基因表达载体的构建

紫苏FAD3基因表达载体的构建重庆师范大学生命科学学院生物科学(师范)专业2009级指导教师摘要：内质网型3—3脂肪酸去饱和酶(FAD3)是不饱和脂肪酸合成途径中催化十八碳二烯酸】18:2(9,12)］转化为十八碳三烯酸】18:3(9,12,15)］的关键酶。通过PCR方法从紫苏叶子克隆到FAD3基因的全长cDNA序列，并将其连接到pUCm-T载体上扩增目基因片段，用Sall和EcoRI对目的片段进行双酶切后，与Sall和EcoRI双酶切后的pBK-CMV质粒连接，得到原核表达载体。该实验成功地构建了硝23基因的原核表达载体，并将该表达载体转化至E.coilBL21(DE3)表达菌株中，为后续研究FAD3基因的表达与功能奠定了基础。关键词：FAD3基因；克隆；表达载体Abstract：Theendoplasmicreticulumomega-3fattyaciddesaturase(FAD3)isthekeyenzymewhichcatalyzes18:2(9,12)toform18:3(9,12,15)intheunsaturatedfattyacidbiosynthesis.ThefulllengthofthecDNAofFAD3wasisolatedbyPCRfromperillaleaves.TheFAD3genewasligatedwithcolonyvectorpUCm-Ttobeamplified.Thefragmentwasdouble-digestedwithSallandEcoRI,andligatedwithexpressionvectorpBK-CMV.ProkaryoticexpressionvectorofFAD3genewassuccessfullyconstructedandtransformedintoEscherichiacoliexpressionstrainBL21(DE3).ThisstudylaidthefoundationforsubsequentexpressionandfunctionalanalysisofFAD3gene.Keywords：FAD3gene；clone；Expressionvector1引言1.1a-亚麻酸植物油的主要成分是脂肪，而脂肪由饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸组成。根据碳分子间双键出现的位置，不饱和脂肪酸又可分为3-3和3-6两类。a-亚麻酸是属于3-3类多不饱和脂肪酸，是人体必需脂肪酸，在人体自身不能合成，必须从食物中摄取［1］。a-亚麻酸作为人体必需脂肪酸，是体内各组织生物膜的结构材料，也是合成人体一系列前列腺素的前体。正常人从食物中摄取a-亚麻酸后，经酶的作用，生成一系列代谢产物，其中最重要的是EPA和DHA⑵°EPA是体内三烯前列腺素前体，DHA是大脑、视网膜等神经系统磷脂的主要成分。EPA具有降低血脂和改善血小板凝固作用，可预防脑血栓和心肌梗塞等疾病⑶。而DHA则具有促进神经系统发育、提高记忆力和视网膜反射能力、预防老年痴呆症、预防癌症和抗过敏症等功效⑶。大量的基础研究、流行病学调查、动物试验及临床观察表明，a-亚麻酸具有以下几方面的生理功效，被国际医学界、营养学界所认可：预防心脑血管病；降血脂;降低临界性高血压；抑制癌症的发生和转移；抑制过敏反应、抗炎作用；抑制衰老；增强智力；保护视力囹。1.23-3脂肪酸去饱和酶及3-3脂肪酸去饱和酶基因植物中亚麻酸是由3-3脂肪酸去饱和酶(FAD)催化亚油酸而来［5］。对于不同的3-3去饱和酶，按照定位不同可以将3种去饱和酶分成两类，其中FAD3定位于内质网，FAD7、FAD8定位于质体⑹。FAD3蛋白通过4个跨膜结构域铆定在内质网膜上，其中一段包括N端、C端以及组氨酸活性位点框暴露于细胞质一侧⑹，其主要作用是催化亚油酸(18：2A9,12)转化为a-亚麻酸(18：3A9,12,15)［7］。因此FAD3对于植物中a-亚麻酸的含量有重要的影响。近年来，人们对于内质网型3-3脂肪酸去饱和酶基因(FAD3)的研究也越来越深入。Murakami等使烟草中3-3脂肪酸去饱和酶的编码基因沉默，导致突变植株的亚麻酸比野生型植株明显减少，突变株能更好地适应高温环境［8］。2005年Zhang等将内质网型FAD3基因转入烟草中，转基因植株不同程度的提高了烟草的抗干旱能力［9］。以上研究说明，FAD3基因不仅可以改善植物亚麻酸含量，还可以改善植物的抗旱能力。1.3紫苏3-3脂肪酸脱氢酶研究含有a-亚麻酸的高等植物有唇形科、亚麻科、胡桃科、十字花科等部分植物［1］。其中紫苏是目前发现的含a-亚麻酸最丰富的特殊油料植物，其油脂中亚麻酸的含量占总脂肪酸的56%-65%；其次才为亚麻籽，亚麻酸含量为57%左右，所以说，紫苏是研究脂肪酸代谢积累和基因克隆的良好材料⑶。紫苏是唇形科紫苏属的一年生自花受粉草本植物。紫苏的种子称为苏籽，其叶称为苏叶，是中国卫生部首批公布的既是食品又属药品的60种中药之一［10］。紫苏作为新型的油料作物越来越受到国内外的关注。Chuny等人从紫苏中克隆出能催化亚油酸形成亚麻酸的3-3脂肪酸去饱和酶基因。Hamada等人用微体3-3脂肪酸去饱和酶DNA对烟草进行转化，在转基因植株根组织中亚麻酸含量提高了40%［11］。因此，深入研究紫苏FAD3基因的功能，通过基因工程的手段来提高其他作物的亚麻酸含量，为人类提供更加丰富的、有益的食用或医用油脂。2材料与方法2.1材料2.1.1实验样本紫苏叶片2.1.2引物设计根据GenBank已发表的FAD3基因序列，设计引物如下：Fprimer:TCCCCCGGGATGGCCGTTTCTTCCGGTGC（下划线为SMAI酶切位点）Rprimer:AAAACTGCAGTTGGCAATCAAGAGTCCATCAC（下划线为PSTI酶切位点）2.1.3主要仪器设备超低温冰箱、离心机、PCR仪、超净工作台、电泳仪、恒温培养箱、紫外仪。2.1.4实验试剂及材料限制性内切酶Sall和EcoRI酶、T4DNALigase、pUCm-TSimpleVector、Sanprep柱式DNA胶回收试剂盒、Takara逆转录试剂盒、LAtaq酶、连接试剂盒、DNAmarker(2000bpladder)、pBK-CMVVector、高纯度质粒抽提试剂盒、氨苄青霉素，LB固体培养基。2.2方法2.2.1紫苏总RNA的提取及cDNA的合成根据TrizolReagent说明书，提取25天的紫苏叶片总RNA，以电泳和紫外分光光度计检测其浓度和纯度，然后按照Takara逆转录试剂盒说明合成cDNA，作为扩增基因的模板。2.2.2硝Q3基因的扩增以cDNA为模板，加入设计的特异性引物，进行PCR，合成特异的目的基因片段FAD3OPCR条件如下：94°C下5min预变性，94°C30s，57°C30s，72°C1min，32个循环，最后，72C延伸10min，4C保存。PCR扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测和SanPrep柱式DNA凝胶回收试剂盒回收后，与pUCm-T载体于16C过夜连接，将连接产物转化入制备好的大肠杆菌DH5a感受态细胞，在含有X-gal和IPTG的含氨苄青霉素(Amp)的匚8固体培养基上生长，37C倒置培养过夜，进行蓝白斑筛选。挑选白斑单菌落，通过菌落PCR筛选阳性克隆，再对阳性克隆的菌落进行测序，确定阳性克隆没有点突变，或其突变对氨基酸序列没有影响。2.2.3表达载体pBK-CMV-^4D5的构建运用高纯度质粒抽提试剂盒抽提pUCm-T-FAD3质粒和pBK-CMV载体质粒。将这两种质粒用限制性内切酶Sall和EcoRI酶分别进行双酶切，进行琼脂糖凝胶电泳检测，再用SanPrep柱式DNA凝胶回收试剂盒回收目的片段。利用T4DNA连接酶16C连接过夜，以连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，涂布于含有kan的LB固体培养基上于37C倒置培养16h，观察菌落的生长情况。挑取白色单菌落质粒，经PCR鉴定，筛选阳性重组子。

3 结果与分析3.1总RNA的提取利用trizol法提取紫苏叶片的总RNA,经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测的，结果表明无明显杂质和降解如图3-1所示，可以用于逆转录。s8s8ss8s8s1190bp1190bp3.2FAD3基因片段的PCR扩增用设计的上下游引物，以紫苏基因组DNA为模板进行PCR，FAD3基因的扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳后，结果如图3-2所示，扩增的目的片段的长度与预期的1190bp一致。2000bp1000bp750bp500bp250bp100bpM：DNAmarker1：FAD3基因图3-2FAD3基因电泳3.3中间克隆载体的构建与鉴定

将该片段纯化连接入pUCmT载体中，转化大肠杆菌，进行蓝白斑筛选如图3-3所示，挑取白斑单菌落进行测序，结果表明目的基因已经连入载体中。图3-3图3-3蓝白斑筛选3.4原核表达载体pBKCMV的构建与鉴定将双酶切获得的目的片段如图3-4,和用相同的限制性内切酶双酶切载体pBK-CMV，回收纯化后16°C过夜连接，取连接产物1ul为模板，T7、T3为引物进行PCR，再用琼脂糖凝胶电泳进行检测，由图3-5可知，有一段片段大约在1400bp，另有一段片段在188bp，表明目的片段与pBK-CMV载体已连接成功，但也存在载体自连。取剩下的连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)，并将其在含有卡那霉素的LB平板上过夜培养，菌落PCR结果显示全为阴性。3963bp2773bp1190bpM11400bp188bp3963bp2773bp1190bpM11400bp188bpM：DNAmarkerMM：DNAmarker1：连接产物图3-5连接产物PCR鉴定1：连接产物图3-5连接产物PCR鉴定2：pUCm-T-FAD3质粒双酶切图3-4pUCm-T-FAD3双酶切4讨论本实验，我们运用triol法提取了紫苏的总RNA,通过逆转录获得cDNA,通过设计特异性引物最终得到目的基因FAD3,并通过琼脂糖凝胶来检测此片段。克隆过程中，我们使用了T载体进行A/T亚克隆。由于PCR产物在扩增时会自动在两端加上腺苷酸A，而设计好的T载体两粘端恰好是T，因此能进行配对连接起来。并通过蓝白斑筛选、测序鉴定重组子。从设计的酶切位点处切下目的片段定向克隆到表达载体上，使得酶切更准确。因为PCR产物酶切效率易受TaqDNA聚合酶的影响，酶切效率低且效果难以判断。许多实验已证明应用T载体进行亚克隆比直接酶切PCR产物进行克隆成功率更高。FAD3基因原核表达载体的构建，为以后通过基因工程提高油料作物中亚麻酸的含量提供便利。参考文献：冯学金，刘根科，韩明.a-亚麻酸研究及植物资源利用[J].内蒙古农业科技,2004(2):22.于修烛，李志西，杜双奎，等.a-亚麻酸保健功效及苏子油研究进展[J].粮油食品科技，2002,10(5):28-30.李丽萍，韩涛.富含a-亚麻酸植物资源的开发与利用[J].食品科学,2007,11(28):619.HarrisWS.Extendingthecardiovascularbenefitsofomega-3Fattyacids[J].CurrAtherosclerRep.2005,7(5):375-380.张洪涛，杨家森，单雷，等.大豆3-3脂肪酸脱氢酶基因GmFAD3C在酿酒酵母中的表达[J].生物工程学报,2006,1(1):33.戴晓峰，肖玲,武玉花，等.植物脂肪酸去饱和酶及其编码基因研究进展[J].植物学通报,2007,24(1):106-107,109.丁一，王华森，于超.番茄内质网3-3脂肪酸去饱和酶基因原核表达载体的构建与鉴定[J].生物技术通报,2012(1):79.MurakamiY,TsuyamaM,KobayashiY,etal.Trienoicfattyacidsandplanttoleranceofhightemperature.Science,2000,287(5452):476-479.ZhangM,BargR,YinM,etal.Modulatedfattyaciddesa