lc-msms法同时测定四逆汤中11个有效成分

lc-msms法同时测定四逆汤中11个有效成分

四逆汤是东汉著名的医疗明星张仲景的名字。它是在《伤寒论》中注册的。整个方剂由生附子、干姜和烤甘草组成。具有回阳、调阳、救精、防少阴病，如四肢听力损失、下肢清澈、呕吐、腹痛、苔藓白腻、脉搏缓慢或细。现代药理研究证实,四逆汤具有强心、升压、抗休克、抗心肌缺血、抗动脉粥样硬化和提高免疫功能等作用,且全方合用效果明显优于各单味药或任意两两组合,维持时间持久。乌头类生物碱、姜酚、甘草皂苷和甘草黄酮是四逆汤中的主要有效成分。乌头类生物碱以C19双酯型二萜类生物碱(乌头碱、新乌头碱和次乌头碱)毒性最强,易导致严重的心律失常、呼吸抑制和休克。故临床上使用附子需经过炮制,将剧毒性的双酯型二萜生物碱水解为毒性较小的单酯型(苯甲酰乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱和苯甲酰次乌头原碱)及毒性更小的醇胺型(乌头原碱、新乌头原碱和次乌头原碱)生物碱。姜酚是干姜的主要活性成分,具有强心、改善血液循环、降血脂和抗氧化的作用。甘草主要含甘草酸、甘草次酸等三萜皂苷类以及甘草苷、甘草素等黄酮类成分,对心血管疾病有广泛的治疗作用。而《中国药典》2010年版一部仅以甘草酸作为四逆汤的成分定量测定标准,未对其他活性成分进行监测。本研究建立了液相-质谱联用(LC-MS/MS)色谱法同时测定四逆汤中乌头碱、新乌头碱、次乌头碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、乌头原碱、次乌头原碱、甘草苷、甘草酸和6-姜酚的量的方法,可为其质量控制研究提供依据。1仪器和试剂盒1.1高效液相色谱法ABI4000Q-Trap质谱仪(美国ABI/SCIEX公司),配有电喷雾离子化源(ESI)、三级四极杆质量分析器以及Analyst1.4.2数据处理软件;日本岛津LC-20A超高速液相色谱仪;BeckmanAllegra64R高速冷冻离心机(美国Beckman公司);XS-105电子天平(瑞士MettlerToledo公司);Millpore纯水机(美国Millipore公司);Thermo超低温冰箱(美国Thermo公司)。1.2药品、文献和对照品生附子购自安徽亳州药材公司,干姜和炙甘草均购自上海养和堂中药饮片有限公司,经上海中医药大学中药学院魏莉副研究员鉴定分别为毛茛科植物乌头AconitumcarmichaeliiDebx.子根的加工品,姜科植物姜ZingiberofficinaleRosc.的干燥根茎及豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根和根茎。新乌头碱(批号110798-200805)、次乌头碱(批号110799-201106)和地西泮(批号115-9302)均购自中国药品生物制品检定所;乌头碱(批号20120211)、苯甲酰乌头原碱(批号20130105)、苯甲酰新乌头原碱(批号20121210)、苯甲酰次乌头原碱(批号20121210)、乌头原碱(批号20121210)和甘草酸(批号20120910)均购自上海源叶生物科技有限公司;甘草苷(批号ZL20120219GCG)和6-姜酚(批号ZL20120422JF)均购自南京泽朗医药科技有限公司。次乌头原碱(批号MUST-13061403)购自成都曼斯特生物科技有限公司。除次乌头原碱(纯度≥90%)外,其余对照品纯度均≥98%。甲醇、乙腈(色谱纯)购自美国TEDIA公司;其他试剂均为分析纯。水为去离子水。2方法和结果2.1流动相a/cAgilentEclipseXDB-C18色谱柱(4.6mm×150mm,5μm);流动相A为含4mmol/L乙酸铵和0.08%甲酸水溶液,流动相B为乙腈,梯度洗脱(0~1min,40%B;1~4min,40%B~90%B;4~9min,90%B;9.5~16min,40%B)。体积流量0.8mL/min;进样量10μL;柱温30℃。2.2tem及多反应检测模式电喷雾离子源(ESI),正离子扫描,离子源喷雾电压(IS)3000V,离子化温度(TEM)500℃,喷雾气压(GS1)60psi(1psi=6.895kPa),辅助气压(GS2)60psi。多反应检测(MRM)模式。11种被测成分的离子对、去簇电压(DP)、碰撞能量(CE)和碰撞室射出电压(CXP)见表1。2.3标准贮备液的配制分别精密称取乌头碱、新乌头碱、次乌头碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、乌头原碱和次乌头原碱适量,加入乙腈溶解并定容,摇匀,即得贮备液,-20℃冷藏备用。精密称取甘草苷、甘草酸和6-姜酚适量,分别置于10mL量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度作为标准贮备液,4℃冰箱保存。用乙腈溶解地西泮,制成质量浓度为0.25mg/mL的内标贮备液,并用乙腈稀释至2.5ng/mL。2.4制备汤剂制备依照《中国药典》2010年版中四逆汤处方比例,取各味饮片(生附子30g,干姜20g,炙甘草30g),加8倍量水,浸泡30min,水沸后再煎30min,趁热过滤,药渣加入6倍量水,同法煎煮30min,合并两次滤液,减压浓缩至1mL含0.2g生药。平行制备3个批次,批号分别为20130921、20130923、20130925。4℃冰箱冷藏备用。将制得的汤剂至离心机中10000r/min离心10min。各样品进样分析前,与2.5ng/mL地西泮内标乙腈溶液按体积比1∶3涡旋混合30s,离心(10000r/min)10min,0.45μm的微孔滤膜滤过,按“2.1”项和“2.2”项下条件分析。2.5准分离主溶液的制备按配伍剂量及供试品溶液制备方法制备同时不含生附子、干姜、炙甘草的阴性对照溶液。2.6干扰成分检测在该实验条件下,分别精密吸取混合对照品溶液、四逆汤煎煮液及阴性对照溶液各10μL进样,结果显示阴性对照溶液未检测到干扰成分,按出峰顺序11种成分乌头原碱、次乌头原碱、甘草苷、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、新乌头碱、甘草酸、乌头碱、次乌头碱、6-姜酚和内标(地西泮)的保留时间分别为1.57、1.59、1.75、2.17、2.53、2.81、3.68、3.90、5.05、5.27、7.77、8.14min。色谱图见图1。2.7苯甲酰钻头原碱和甘草苷的质量浓度精密量取各对照品溶液适量,用乙腈稀释成系列混合对照品溶液(乌头碱、新乌头碱的质量浓度均为0.01、0.025、0.075、0.1、0.3、1、2.5ng/mL;次乌头碱、苯甲酰次乌头原碱、乌头原碱和次乌头原碱的质量浓度均为0.1、0.25、0.75、1、3、10、25ng/mL;苯甲酰乌头原碱的质量浓度为0.05、0.125、0.375、0.5、1.5、5、12.5ng/mL;苯甲酰新乌头原碱的质量浓度为0.2、0.5、1.5、2、6、20、50ng/mL;甘草苷的质量浓度为6、15、45、60、180、600、1500ng/mL;甘草酸的质量浓度为10、25、75、100、300、1000、2500ng/mL;6-姜酚的质量浓度为4、10、30、40、120、400、1000ng/mL),按“2.1”项和“2.2”项下条件分析,以对照品质量浓度(X)为横坐标,待测物峰面积As与内标峰面积Ais的比值(Y)为纵坐标,作加权线性回归计算,结果表明各成分在相应的线性范围内线性关系良好(见表2)。2.8仪器精密度试验精密吸取混合对照品溶液(含乌头碱、新乌头碱均为0.30ng/mL,次乌头碱、苯甲酰次乌头原碱、乌头原碱和次乌头原碱均为3.0ng/mL,苯甲酰乌头原碱为1.5ng/mL,苯甲酰新乌头原碱为6.0ng/mL,甘草苷180ng/mL,甘草酸300ng/mL,6-姜酚120ng/mL),按“2.1”项和“2.2”项下条件连续进样5次,将峰面积比值代入当天标准曲线计算浓度,求得精密度,结果表明仪器精密度良好,乌头碱、新乌头碱、次乌头碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、乌头原碱、新乌头原碱、甘草苷、甘草酸和6-姜酚的RSD值分别为2.1%、2.7%、2.8%、4.0%、3.5%、4.1%、3.3%、2.4%、4.0%、3.6%、1.7%。2.9重复性试验结果同一批四逆汤样品,平行取样6份,按“2.4”项下方法制备供试品溶液,按“2.1”项和“2.2”项下条件分析,测定各化合物的量,结果乌头碱、新乌头碱、次乌头碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、乌头原碱、新乌头原碱、甘草苷、甘草酸和6-姜酚的RSD值分别为1.9%、3.1%、2.8%、4.3%、5.5%、5.0%、3.3%、2.2%、3.0%、2.6%、1.4%,表明方法重复性良好。2.10不同植物品种抗氧化性取四逆汤同一供试品溶液在室温下放置0、2、4、8、12h,按“2.1”项和“2.2”项下条件分别进样分析,根据标准曲线计算,结果乌头碱、新乌头碱、次乌头碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、乌头原碱、新乌头原碱、甘草苷、甘草酸和6-姜酚的RSD值分别为3.8%、2.2%、2.0%、4.0%、1.9%、1.8%、3.5%、2.0%、1.7%、0.92%、2.0%,表明样品溶液在12h内稳定。2.11加样回收率试验精密量取已知11种成分含有量的四逆汤水煎液,平行6份,分别加入上述混合对照品溶液适量(每1mL含乌头碱1.25ng、新乌头碱3.12ng、次乌头碱46.1ng、苯甲酰乌头原碱14.9ng、苯甲酰新乌头原碱110ng、苯甲酰次乌头原碱52.4ng、乌头原碱3.32ng、次乌头原碱5.93ng、甘草苷2501ng、甘草酸4252ng、6-姜酚755ng),按照“2.4”项下制备供试品溶液,依法测定,结果乌头碱、新乌头碱、次乌头碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、乌头原碱、次乌头原碱、甘草苷、甘草酸和6-姜酚的平均回收率为103%、96.2%、101%、95.4%、97.0%、98.3%、96.7%、95.7%、99.4%、98.3%、100%,RSD分别为2.1%、1.8%、1.3%、2.4%、3.5%、0.82%、1.5%、2.4%、2.7%、1.9%、2.3%,表明各成分加样回收率良好。2.12测定指标及方法精密吸取3个批次的四逆汤样品,每批样品平行测定3次,按“2.1”项和“2.2”项下条件分析测定,以内标法计算各成分的量。结果见表3。3ms/ms法四逆汤是一首组方简单、疗效确切的经典方,临床应用广泛。由于中药复方是复杂体系,经多成分多途径协同作用而发挥药效,因此建立多组分同时定量的分析方法,对全面控制四逆汤的质量具有重要的意义。既往文献对四逆汤的活性成分大多采用高效液相色谱法进行检测,要求各种成分色谱峰完全分离,分析时间较长,多在30min左右,并且最小检测质量浓度均在5μg/mL以上。而串联质谱法(MS/MS)专属性强,灵敏度高,不要求各种成分色谱峰完全分离,快速高效。实验采用水提的方法对药材进行处理,而未采用《中国药典》中所述氨水润湿后以异丙醇-二氯甲烷(1∶1)混合液溶解提取的方法,主要是考虑到此方法只是单纯的针对附子双酯型生物碱而言,而本课题主要应用于四逆汤方剂研究,所以采用煎煮法,保证与传统给药方案的一致性。本实验所建的色谱条件相对温和,梯度洗脱,以乙腈-水为流动相,可以有效降低系统压力。而且由于乌头类生物碱具有弱碱性,