酶-酶的提取与分离纯化（生物化学课件）

酶的分离纯化

酶的提纯手段一般都是依据酶的分子大小、形状、电荷性质、溶解度、专一结合位点等性质而建立的。要得到纯酶，往往需要将各种方法联合使用酶提纯的主要方法

一、调整酶溶解度的方法1、改变离子强度2、改变pH或温度3、改变介电常数（有机溶剂沉淀法）4、萃取

二、根据酶分子大小、形状不同的方法1、离心分离2、凝胶过滤3、透析、超滤

三、根据酶分子电荷性质的方法1、离子交换柱层析2、电泳3、凝胶电泳4、等电聚焦电泳

四、根据酶分子专一性结合的方法1、亲和层析2、免疫吸附层析3、共价层析

五、其他分离方法无机吸附层析，巯水吸附层析、浓缩、干燥、薄板层析、高效液相色谱(HPLC)、亲和超滤、亲和分配、亲和电泳等这些方法有的处理量大、有的简便易行，有的快速高效、特异性高

六、酶纯化方法的选择制备的规模和要求酶的产量允许用以制备的时间实验室可利用的人员和设备

根据溶解度变化建立的纯化方法较适宜于早期的纯化阶段，规模较大；而柱层析法(如离子交换层析)或电泳分离更适宜于后期的纯化过程，规模较小酶的提取酶的提取

酶的提取是指在一定条件下，用适当的溶剂处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂中的过程。也称为酶的抽提。首先应根据酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂大多数酶能溶解于水，可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液提取有些酶与脂质结合或含较多的非极性基团，则可用有机溶剂提取为了提高酶的提取率并防止酶的变性失活，在提取过程中，要注意控制好温度、pH值等各种条件一、酶的提取方法

提取方法使用的溶剂(液)提取对象盐溶液提取0.02–0.5mol/L的盐溶液用于提取在低浓度盐溶液中溶解度较大的酶酸溶液提取pH2-6的水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大且稳定性较好的酶碱溶液提取pH8-12的水溶液用于提取在稀碱溶液中溶解度大且稳定性较好的酶有机溶剂提取可与水混溶的有机溶剂用于提取那些与脂质结合牢固或含较多非极性基团的酶

二、影响酶提取的主要因素

1、温度

2、pH值

3、提取液的体积二、影响酶提取的主要因素1、温度为了防止酶的变性失活，提取时温度不宜高特别是采用有机溶剂提取时，温度应控制在0～10℃（有些酶对温度的耐受性较高，如酵母醇脱氢酶、细菌碱性磷酸酶、胃蛋白酶等，可在37℃或更高一些温度下提取）在不影响酶的稳定性的条件下，适当提高提取温度，可以提高酶的扩散速率，增加酶的溶解度，有利于酶的提取和进一步的分离纯化

二、影响酶提取的主要因素2、pH值溶液的pH值对酶的溶解度和稳定性有显著的影响为了增加酶的溶解度，提取时溶液的pH值应该远离酶的等电点但是除了酸溶液提取或碱溶液提取以外，提取时溶液的pH值不宜过高或过低，以防止酶的变性失活二、影响酶提取的主要因素3、提取液的体积提取液的用量增加，可提高提取率过量的提取液，使酶浓度降低，对进一步的分离纯化不利提取液的用量一般为含酶原料体积的3～5倍。可一次提取，也可分几次提取，若辅以缓慢搅拌，则可提高提取率

酶细胞破碎酶蛋白分布三种情况胞外酶－－释放到细胞外溶酶－－游离在细胞内结酶－－牢固与膜或细胞颗粒结合在一起胞外酶：盐析、沉淀等从发酵液中沉淀酶，制成酶泥。胞内酶：收集菌体，破碎细胞后提取。胞内酶酶细胞破碎方法及其原理分类破碎方法原理机械破碎法捣碎法通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎研磨法匀浆法物理破碎法温度差破碎法通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎压力差破碎法超声波破碎法化学破碎法添加有机溶剂通过各种化学试剂对细胞膜的作用，使细胞破碎添加表面活性剂酶促破碎法自溶法通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，达到细胞破碎外加酶制剂法机械破碎法方法作用过程适用范围捣碎法捣碎机高速旋转叶片产生剪切力，将组织细胞破碎动物内脏，植物叶芽等脆嫩组织，细菌细胞研磨法研钵、石磨、细菌磨、球磨等研磨器械产生的剪切力，将组织细胞破碎微生物细胞、植物组织细胞匀浆法匀浆器产生的剪切力，将组织细胞破碎破碎程度高，用于易分散、较柔软、颗粒细小的组织细胞物理破碎法方法作用过程适用范围温度差破碎法温度突然变化，由于热胀冷缩作用而使细胞破碎较脆弱、易破碎的细胞压力差破碎法高压冲击；突然降压；渗透压变化G－菌，膜结合酶、细胞间质酶。对G＋不适用超声波破碎法声波或超声波的作用，使细胞膜产生空穴作用而使细胞破碎微生物细胞化学破碎法方法试剂作用过程有机溶剂甲苯、丙酮、丁醇、氯仿破坏细胞膜磷脂结构，改变膜透性，使胞内酶等释放到胞外，低温下进行防止酶失活。表面活性剂Triton、吐温与膜中磷脂及脂蛋白作用而破坏膜结构，从而增加膜的透过性。一般采用非离子型，离子型会破坏酶的空间结构。酶促破碎法方法试剂作用过程自溶法细胞自身的酶系在一定的pH值、温度和离子强度下，细胞本身的酶系作用使细胞破坏，释放出胞内物质