一测多评法在五味子质量控制中的应用

一测多评法在五味子质量控制中的应用

五味子是木兰科植物的五味子schidandarchnatica（turcz.）ball的干燥成熟果实，被称为“北五味子”。木脂素类成分是五味子的主要药用成分,具有抗肿瘤、抗病毒、保肝、抗衰老等作用。目前已有同时测定五味子中多个木脂素类成分含量的相关报道,但这些方法难以在实际工作中广泛应用,其主要原因是对照品价格昂贵、有时难以获得高纯品,因此,如何实现对五味子多指标成分的整体控制,是目前五味子质量控制中有待解决的关键问题。本文建立五味子一测多评法(quantitativeanalysisofmulti-componentsbysinglemarker,QAMS),实现对五味子4种木脂素类成分的质量控制,即选用其中使用广泛的五味子醇甲,建立该成分与五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素间的相对校正因子,计算出各成分的含量,实现了用单一对照品对五味子药材进行多指标的质量控制。高效液相色谱法材料与仪器五味子药材均购自吉林,批号不同。五味子醇甲(110857-200405)、五味子酯甲(111529-200604)、五味子甲素(110764-201010)、五味子乙素(110765-200407)均购自中国食品药品检定研究院。乙腈为色谱纯,水为超纯水,甲醇为分析纯。Agilent1100高效液相色谱仪(美国Agilent公司),Agilentchemstation工作站;LC-20A高效液相色谱仪(日本岛津公司),LCsolution工作站。KromasilC18(250mm×4.6mmID,5μm),DiamonsiC18(250mm×4.6mmID,5μm),HederaODS-2(250mm×4.6mmID,5μm)。液相色谱条件色谱柱KromasilC18(250mm×4.6mmID,5μm);流动相:A为乙腈,B为水,梯度洗脱条件,0~10min,A:41%~46%;10~45min,A:46%~66%;45~50min,A:66%~83%;50~55min,A:83%~83%;流速1mL·min-1,柱温40℃,检测波长254nm。对照品溶液的制备精密称取五氧化二磷减压干燥至恒重的五味子醇甲4.40mg、五味子酯甲5.91mg、五味子甲素4.12mg和五味子乙素5.37mg,置10mL量瓶中,加甲醇至刻度,精密移取上述4个对照品溶液各2mL,置于10mL量瓶中,加甲醇定容,为混合对照品溶液。将上述混合对照品于4℃保存,备用。供试品溶液的制备取样品粉末(过3号筛)各约1g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇50mL,称定重量,超声处理(功率250W,频率20kHz)40min,取出,加甲醇补足损失的量,摇匀,滤过,取续滤液,过0.45μm滤膜,即得。结果1方法研究1.1hplc-1的色度图显示了对照和样品的色度图1.2线性及归归方程精密吸取混合对照品溶液1、2、4、6、10、16和20μL,进样分析,每个浓度进样3次,取平均值。以进样量对峰面积积分做标准曲线,用最小二乘法进行线性回归,得到各对照品的回归方程以及线性范围,分别为五味子醇甲:Y=170.94X+0.0231,r=0.9999,线性范围:0.0880~1.760μg;五味子酯甲:Y=163.50X-8.3701,r=0.9999,线性范围:0.1182~2.364μg;五味子甲素:Y=175.58X-10.315,r=0.9999,线性范围:0.0824~1.684μg;五味子乙素:Y=184.95X-10.895,r=0.9999,线性范围:0.1074~2.148μg,表明得到的各标准曲线在线性范围内,线性关系良好。1.3他组分m峰面积其中Ak为内标物峰面积,Wk为内标物浓度,Am为其他组分m峰面积;Wm为其他组分m浓度。计算待评价成分五味子酯甲(B)、五味子甲素(C)和五味子乙素(D)与内参物五味子醇甲(A)的相对校正因子,结果见表1。1.4仪器精密度试验精密吸取同一浓度的供试品溶液10μL连续进样6次,记录五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素的峰面积积分值,计算RSD,结果日内精密度各成分峰面积的RSD分别为1.02%、1.71%、0.98%和1.18%,精密吸取同一供试品溶液10μL连续进样2d,每天3次,记录峰面积积分值,日间精密度各成分峰面积的RSD分别为0.98%、1.61%、1.23%和1.36%,表明仪器精密度良好。液在2d内稳定。1.6重复性试验结果称取同一批五味子药材粉末(过40目筛)约1g,精密称定,按供试品制备方法制备6份供试品溶液,测定峰面积积分值,计算RSD,结果五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素稳定性的RSD分别为2.36%、1.42%、1.54%和0.82%,表明该方法的重复性良好。1.7加样回收率和rsd称取已知含量的五味子药材粉末1g(过40目筛)6份,精密称定,加入一定量的混合对照品溶液各1mL,按供试品制备方法制备供试品溶液,测定并计算各成分的加样回收率以及RSD。结果五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素的加样回收率分别为99.8%、99.2%、100.5%和101.2%,RSD分别为1.31%、1.42%、0.77%和0.85%,表明该方法的准确度良好。2重建因素的再现研究2.1相对校正因子的测定采用KromasilC18(4.6mm×250mm,5μm)色谱柱,精密吸取混合对照品溶液2、10和16μL,进样分析,分别考察了Agilent1100和LC-20A2种不同高效液相色谱仪对五味子木脂素类成分相对校正因子的影响,结果各成分相对校正因子见表2,重现性良好(RSD<5%)。2.2药代动力学测定结果采用Agilent1100高效液相色谱仪,精密吸取混合对照品溶液2、10和16μL,进样分析,分别考察了KromasilC18、DiamonsiC18和HederaODS-2色谱柱对五味子木脂素类成分相对校正因子的影响,结果各成分相对校正因子见表3,重现性良好(RSD<5%)。2.3色谱峰的判别利用相对保留值(ras=tRa/tRs)定位,即根据内参物的保留时间、待测组分的相对保留值和色谱峰的紫外吸收特征,便能够正确判断出目标峰的位置。分别考察了2种高效液相色谱仪和4种不同型号色谱柱下对比参数,结果可知RSD<5%,表明可利用相对保留值(表4)进行定位。3相色谱法分别精密吸取13批五味子药材供试品溶液各10μL,注入高效液相色谱仪测定。采用外标法和一测多评法计算五味子药材中五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素的含量,结果表明2种含量测定方法无显著性差异,RSD≤1.6%,见表5。提取方法的确定选择五味子醇甲为内参物是因为五味子醇甲为药典规定五味子质量控制指标性成分,且该对照品易得。根据目标峰与内参物峰之间的相对保留值,结合各峰的紫外吸收特征、峰形等信息,即能够正确判断出各目标峰的准确位置。考察了2种不同高效液相色谱仪和3种不同品牌色谱柱对五味子木脂素类成分相对校正因子的影响,结果发现各成分相对校正因子重现性良好(RSD<5%)。考察了50%甲醇、70%甲醇、85%甲醇、纯甲醇和无水乙醇对五味子中4种木脂素类成分提取率的影响,结果表明以纯甲醇提取4种成分提取率均最高,且提取杂质较少。以纯甲醇为提取溶剂,考察超声和回流两种提取法对4种木脂素类成分提取率的影响,结果表明超声40min和回流2h提取4种成分提取率无显著差异,考虑回流时间长,操作较繁琐,所以选择超声法为提取方法。以甲醇为溶剂,分别超声30min、40min、50min和1h,结果表明40min后4种成分提取率无明显增加。所以最终确定以纯甲醇做提取溶剂超声40min为制备供试品溶液方法。比较了甲醇-水和乙腈-水不同比例梯度洗脱效果,结果发现乙腈-水洗脱分离效果好于甲醇-水,达到基线分离,尤其在五味子酯甲分离上尤为明显,且甲醇-水洗脱柱压较大,所以选择乙腈-水梯度洗脱系统为流动相。采用一测多评法所得五味子药材中4种木脂素类成分含量与常规的外标法所测得的含量间无显著差异,说明在无对照品的情况下,通过一测多评法实现五味子药材同类成分的含量测定准确可行。对于不同类型成分应用一测多评法的可行性还需进一步探