草鱼中胶原的分离纯化及其性质研究

草鱼中胶原的分离纯化及其性质研究

0鱼类胶原蛋白的活性近年来，食物安全问题已成为人们关注的问题，而食物过敏问题仍在人们身上。随着物流业的日益繁荣和食品消费的逐年增加，食物过敏已经影响人们的生活。根据流行病学研究，美国每年约有2.5%的人患有食物过敏，5%8%的儿童和婴儿病例发生在5%8%的儿童和婴儿病例中。1999年国际食品法规委员会发布的8种常见的高过敏食品中，有2种。这肉口感细腻，营养价值高，深受消费者喜爱。然而，鱼和虾之间的过敏问题也很常见。由于水的过敏机制和复杂性，目前的研究表明小清蛋是鱼类的主要过敏。2001年，hamada等人首次提出了新的鱼类凝胶。之后，sakaguki等人提取了多种鱼类凝胶，并与过敏患者的血清进行了个性化反应，以验证鱼廉氏蛋白的过敏性。目前，鱼廉氏沉积物的研究主要集中在其性质和加工应用上，对蛋白质和水的过敏研究相对较少。在这项工作中，我们使用了以鲤鱼为实验材料，分离氨基酸含量，分析了蛋白质与小青蛋白之间的稳定性，通过酶联免疫吸收实验和杜射实验分析了钙支架的ige结合活性，并确定了鲤鱼凝胶的过敏性。1材料和方法1.1实验用证据鲜活鲤鱼购于集美农贸市场,现杀,直接用于实验或置于-20℃保存备用;鱼类过敏患者血清取自集美大学医疗中心和厦门市第二医院,血清均放于-30℃冰箱中冻存.1.2试验方法和仪器恒温水浴锅(Memmert,德国);组织捣碎机(Kinematica,瑞士);高速冷冻离心机(Beckman,美国);96孔板酶标仪(Bio-Rad,美国);凝胶成像仪(ViblerLourmat,法国);超纯水系统(Millipore,美国).1.3实验方法1.3.1粗胶原蛋白的提取胶原蛋白的分离纯化参照Zhang等人的方法,并做适当修改.将鲜活鲤鱼宰杀取皮,将皮下肉、结缔组织用刀剔除.将获得的鱼皮剪成约2mm×2mm的碎片,于0.1mol/LNaOH溶液中组织捣碎,4℃下搅拌浸提24h,其中每隔6h换液一次,10000r/min离心15min,去上清,将沉淀充分水洗,溶于质量分数10%正丁醇,充分匀浆,4℃搅拌,浸提24h.随后将有机溶剂处理后的样品进行水洗,溶于0.5mol/LHAc溶液中,轻微搅拌,提取48h,4℃下11500r/min离心20min后所得到的上清液即为粗胶原蛋白.取粗胶原蛋白样品,加入NaCl至其最终浓度为0.9mol/L,4℃下9000r/min离心20min,所得沉淀为纯化的胶原蛋白.所得沉淀复溶于0.5mol/LHAc,0.1mol/LHAc为外液透析3d后冻干备用.1.3.2sds-页面分析SDS分析参照Laemmli法.1.3.3sds-东南角SGF参照美国药典方法配制,猪胃蛋白酶、鲢鱼小清蛋白由本实验室纯化获得.模拟胃液每1L中含有2gNaCl,并用HCl调节pH值至1.2.体外模拟胃液消化中,总反应体积为1mL,在2只试管中分别加入SGF溶液与目的蛋白.其中一只试管中加入7μL酶液,对照试管中加入与酶液等体积的模拟胃液,于37℃水浴锅中振荡后反应,分别反应0、1、5、15、30、60、120min后取样50μL,于预先含有20μL终止液的离心管中混匀终止反应,进行SDS分析.1.3.4gf消化稳定性主要进行胶原蛋白与小清蛋白的热稳定性、pH值稳定性、消化稳定性以及高温高压稳定性的比较.热稳定性比较:将胶原蛋白与小清蛋白于0、20、30、40、50、70、100℃下处理30min;pH稳定性:将胶原蛋白与小清蛋白置于pH值依次为2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、10.0、11.0的缓冲液中,室温下静置1h;消化稳定性参照步骤1.3.3,将胶原蛋白与小清蛋白的质量浓度均调整为0.5g/L,SGF消化0、1、5、15、30、60、120min;高温高压稳定性:将胶原蛋白与小清蛋白置于高压灭菌锅中,于121℃、0.14MPa条件下处理20min.所有处理后的样品进行SDS分析.1.3.5t-hp反应ELISA检测胶原蛋白和小清蛋白的IgE结合活性参照刘光明等人的方法,并做适当修改.将蛋白样品(200ng,每孔100μL)包被于酶标板,于4℃包被16h,随后用TBST洗涤(200μL),加入质量分数5%脱脂奶(200μL)于37℃封闭1.5h,TBST洗涤(5×200μL).随后加入1∶5稀释的鱼类过敏患者血清(50μL),在37℃下孵育2.5h,TBST充分洗涤(5×200μL)后加入1∶2000稀释的羊抗人IgE-HRP(100μL)于37℃孵育1.5h.TBST清洗后加入TMB(100μL)显色液于37℃避光显色20min,2mol/L硫酸溶液(50μL)终止反应,酶标仪测OD450值.1.3.6两组患者血清中dab-hrp的残留Dot-blot分析胶原蛋白的IgE结合活性参照奥斯伯的方法,并做适当修改.剪2块边长约为5mm的硝酸纤维素膜(NC膜),将蛋白质点在NC膜的中央位置.点样结束后以质量分数5%脱脂奶于37℃封闭1.5h,然后用TBST洗去残留.以1∶5稀释的鱼类过敏患者血清为一抗于37℃孵育2h,TBST洗5次,每次5min,然后以1∶2000稀释的羊抗人IgE-HRP为二抗于37℃孵育1h,TBST洗5次,每次5min,最后用DAB显色至膜上出现比较清晰的杂交斑点,拍照.2结果2.1咸鱼胶原蛋白的纯化经过碱溶、有机溶剂处理、酸溶以及NaCl盐析后得到了鲤鱼鱼皮胶原蛋白,其结果见图1.由图1可以看出,鲤鱼的胶原蛋白已经得到高度纯化,鲤鱼胶原蛋白由2条α链组成(α1与α2),其中α1链含量相对较高,分子质量约为120ku,α2链含量相对较低,其分子质量约为115ku.在α链的上方还有大量的β链,分子质量约为250ku,以及少量的大分子γ链.2.2gly缓冲液对小清蛋白的降解图2显示了胶原蛋白与小清蛋白的热稳定性比较结果,从图2中可以看出:当温度低于50℃时,胶原蛋白与小清蛋白均不发生明显变化;当温度上升至70℃时,胶原蛋白开始出现了比较明显的降解,其中大分子的β链开始降解,小分子α链也出现了少量的降解;当温度上升至100℃时,胶原蛋白的3条链均已降解;而随着温度逐渐升高到100℃,小清蛋白均不发生降解,在温度为100℃时,微量的小清蛋白形成了多聚体.图3显示了胶原蛋白与小清蛋白的pH稳定性比较结果,由图3可以看出,只有在pH=2.0的缓冲液中,胶原蛋白与小清蛋白都发生了明显的降解,其中小清蛋白的降解更加明显.推测原因可能是pH=2.0的Gly-HCl缓冲液中Gly的存在影响了蛋白质稳定性.随着pH值的逐渐升高,即使pH值达到11.0,胶原蛋白与小清蛋白均没有出现相应的降解条带,胶原蛋白的3条链都保持完好,小清蛋白也不发生降解,但是相比对照组,二者条带变淡,可能是由于在碱性条件下蛋白质的溶解度有所降低.胶原蛋白与小清蛋白的模拟胃液消化稳定性对比如图4所示.由于这2种蛋白质分子质量差异较大,图4采用了质量分数6%～20%浓度的线性梯度胶.从图4中可以看出,在不加酶的对照组中,加热120min后小清蛋白与胶原蛋白均不发生明显变化.实验组中,在消化进行到1min时,小清蛋白已经呈现比较明显的降解,降解产物分子质量较小,而胶原蛋白的α链、β链均保持完好,γ链出现了少量的降解;在5min时,胶原蛋白的α链、β链仍然不发生降解;当消化进行至15min时,小清蛋白几乎已经消化完全,此时胶原蛋白的β链才开始出现降解趋势,随后它的α1链、α2链才开始出现降解;当消化进行至120min时,胶原的3条链都已经被分解,降解产物的分子质量大约在30～120ku之间.可以看出,小清蛋白的模拟胃液消化稳定性是远远不如胶原蛋白的.胶原蛋白与小清蛋白在高温高压条件下的稳定性比较结果见图5,图5采用了121℃、0.14MPa条件处理20min,并采用质量分数6%～20%浓度的线性梯度胶.由图5可见,高温高压处理后,胶原蛋白的3条链已经完全分解,与单纯加热不同,高温高压处理的分解产物的分子质量比较集中,大约在10～40ku.而小清蛋白同时呈现了2种相反的情况,一部分小清蛋白降解成了小分子片段,同时有一部分小清蛋白发生了聚合反应,形成的多聚体分子质量大约在20～30ku.2.3小鼠血清中cot-blct检测的ige特异性反应图6显示了纯化后的鲤鱼胶原蛋白与过敏患者血清的ELISA结果,其中阴性对照为健康人血清.从图6中可以看出,在8份对鱼类过敏的病人血清中,有3份对鲤鱼胶原产生了特异性IgE反应(1,3,6),而6份血清对鲢鱼小清蛋白发生了特异性IgE反应(1,2,3,4,5,6).同时对胶原蛋白与小清蛋白发生特异性IgE反应的血清有3份(1,3,6).以鲤鱼胶原蛋白为抗原,经过ELISA筛选后的过敏患者血清(6号)为一抗,通过Dot-blot对胶原蛋白的IgE特异性反应验证如图7所示,以健康人血清为一抗的的Dot-blot图中没有出现杂交斑点(图7a),而过敏患者血清与鲤鱼胶原蛋白产生了特异性杂交斑点(图7b、图7c).3分子质量的测定2001年Hamada等人首次提出鱼类胶原蛋白可能为一种新型过敏原,而此前,已经有大量报道证实鱼类的主要过敏原为小清蛋白.目前对于鱼类胶原蛋白引起过敏的研究相对较少,对鱼类胶原蛋白的研究主要集中在其基本性质与工业加工方法上,而关于牛类明胶(主要成分为Ⅰ型胶原)过敏的研究报道却早有出现,并且已经有学者证实了牛类胶原的α2亚基对其致敏性有主要的决定作用.本文通过酸溶法分离纯化得到了鲤鱼鱼皮中的Ⅰ型胶原蛋白,通过SDS分析得到鲤鱼鱼皮胶原蛋白主要由α链(α1与α2)、β链以及γ链组成,其中α1与α2的分子质量分别为120ku和115ku,β链的分子质量约为250ku,这与之前报道的鲢鱼、尖吻鲈等胶原蛋白组成基本相同.通常来说,食物过敏原都有着较高的稳定性,小清蛋白、原肌球蛋白等均耐热耐酸,在加工蒸煮过程中不容易发生降解.本文比较了鲤鱼胶原蛋白与鲢鱼小清蛋白的热稳定性、pH值稳定性、模拟胃液消化稳定性以及高温高压稳定性,结果表明:在热稳定性方面,胶原蛋白不如小清蛋白,当在100℃加热30min后,胶原蛋白的3条链已经完全降解,而小清蛋白几乎不发生降解;2种蛋白的pH值稳定性相似,在pH=2.0的缓冲液中都发生了明显降解,但在pH=3.0～11.0胶原蛋白与小清蛋白都不发生明显变化.在SGF消化过程中,小清蛋白在5min时就发生了明显降解,在15min时基本已经降解完全,而胶原蛋白在30min时才由β链开始发生降解,120min后仍未消化完全.在高温高压处理后,胶原蛋白明显降解,而小清蛋白同时呈现了降解与聚合2种情况.通过鱼过敏患者血清的ELISA实验可以看出,8份对鱼类过敏的病人血清中,3份血清与胶原蛋白和小清蛋白同时发生了特异性IgE结合