大蒜素和它的前药对食管癌细胞eca二十三六分增殖抑制及凋亡基因表达的影响

大蒜素和它的前药对食管癌细胞eca二十三六分增殖抑制及凋亡基因表达的影响

近年来，肿瘤的发病率和死亡率有上升趋势，这是一种普遍而重要的疾病。食管癌是人类消化道的常见肿瘤,我国每年因食管癌死亡者约15万人,占癌症患者死亡率近1/4,位居第二位。我国抗肿瘤药物近10年来取得了令人瞩目的成就。现能生产的抗肿瘤药物(不含免疫调节剂)包括:烷化剂类、抗代谢药、天然抗肿瘤药、抗肿瘤抗生素等,但多数抗肿瘤药物存在毒副作用较大,疗效不稳定、复发率高等问题。因此,寻找一种低毒、疗效稳定、使用方便且具有广谱抗肿瘤活性的药物成为抗肿瘤药物研究和临床中亟待解决的问题。肿瘤的中药治疗是当今临床治疗的重要手段之一,中草药及其活性成分抗肿瘤药物的研究和开发已成为人们关注的热点,我国具有1000多年中草药研究的悠久历史,有很多的古代偏方和有名中医的经验方,开发中草药抗肿瘤药物具有广阔的发展前景。大蒜AlliumsativumL.是历史悠久的药食两用植物,早在4000多年前人们就开始食用大蒜,并用大蒜治疗疾病。大蒜的多种药理作用主要源于它所特有的有机含硫化合物,如蒜氨酸及其分解产物大蒜素等,大蒜组织损伤时释放蒜氨酸酶(Alliinase),蒜氨酸酶催化蒜氨酸缩合形成具有强烈辛辣味的挥发性大蒜素(Allicin,主要成分是二烯丙基硫代亚磺酸脂)。大蒜素遇光、热容易降解成二烯丙基三硫和二烯丙基二硫化合物(DADS)等含硫有机化合物。近年来国内外研究表明,大蒜素对胃癌、结肠癌、前列腺癌、肺癌等癌细胞有明显抑制作用。发现大蒜素通过抑制肿瘤细胞的增殖,影响细胞周期,诱导肿瘤细胞凋亡,对抗癌药具有增敏作用等抑制或杀死肿瘤细胞。大蒜素生物半衰期短(t1/2=2.32h),理化性质不稳定,在常温下可进一步分解,引起分子中二硫键断裂,降解成各种化合物,如阿藿烯类(ajoenes)、乙烯基二硫杂苯类(vinyldithiins)和硫醚类(sulfides)等有机硫化合物,导致活性大大降低,影响其药理作用及疗效。大蒜素前药(蒜氨酸和蒜氨酸酶)较稳定,本实验通过比较大蒜素及大蒜素前药对食管癌Eca9706细胞的增殖抑制作用,以及检测bcl-2、bax、survivin、caspase-3和p53基因在转录水平的变化,为探讨大蒜素及其前药诱导食管癌凋亡的分子机制及抗肿瘤治疗提供可靠的依据。1菌株和生物资源RealTimePCR检测系统(AppliedBiosystems7500型,美国);凝胶成像系统(AlphaInnotechCorporationTM-26型,美国);真空冷冻干燥机(ChristAlpha1-2LDplus型,德国);倒置显微镜(江南XD-101型,中国);酶标仪(FeicBenchmarkPlus型,美国);CO2细胞培养箱(HealForceHF240型,中国)。新鲜大蒜(本地购买),人食管癌Eca9706株由郑州大学基础医学院董子明教授馈赠,新疆生物资源基因工程重点实验室保存。蒜氨酸(Sigma),二烯丙基二硫化物(DADS,纯度为80%,Sigma)。RPMI1640培养基、0.25%胰酶消化液、二甲基甲砜(DMSO)、四甲基硝唑蓝(MTT)、胰酶和10%胎牛血清(鼎国昌盛生物技术有限责任公司);青霉素和链霉素(ICNBiomedicals公司)、引物(上海生工生物技术有限公司);TrizolRNA提取液和SYBRGreenSupermixkit(Invitrogen,上海普飞生物技术有限公司);TagDNA聚合酶、DnaseⅠ、dNTP、RNAse抑制剂、Oligo(dT)、ReverseTranscriptaseM-mLV(RNaseH-)和DNAMarker(均为大连TaKaRa公司产品);其它试剂均为分析纯。2方法2.1大蒜素的测定大蒜素提取方法参照曾哲灵方法进行,得到的大蒜素冷冻干燥,大蒜素干粉得率为2.41g/kg。大蒜素测定参照DTNB比色法进行,测得大蒜素质量浓度为0.3μg/mL。称取大蒜素干粉45mg溶于5mLRPMI1640培养液,配置质量浓度为9mg/mL,过滤除菌,置-20℃冰箱保存。临用前用RPMI1640培养液分别稀释至5、10、15、20、30μg/mL。2.2蒜氨酸酶活力测定称取新鲜去皮蒜瓣200g,4℃预冷,加入预冷的磷酸缓冲液200mL(蒜瓣∶提取液=1∶1,W/V),匀浆。匀浆液在4℃低温下4000r/min离心20min,弃去残渣,在上清液中加入硫酸铵,使饱和度为20%,4℃下静置2h,8000r/min冷冻离心20min,弃沉淀。上清液继续加入硫酸铵,使饱和度达到50%,在4℃下静置过夜,4℃低温下8000r/min冷冻离心20min,沉淀冷冻干燥得到蒜氨酸酶。蒜氨酸酶活力的测定采用丙酮酸法。分离得到的蒜氨酸酶活力单位为24720U/mg,SDS检测有一条主要的蛋白带(图1),其分子质量大小约为54kDa左右,与已有的报道分子质量大小一致。将30mg蒜氨酸和15mg蒜氨酸酶混合溶于5mLRPMI1064培养液,配置成9mg/mL,过滤除菌后置于-20℃冰箱保存。临用时,用RPMI1640培养液分别稀释至5、10、15、20、30μg/mL。2.3大蒜素的活性物质的制备将对数生长期的食管癌细胞Eca9706,用0.25%胰蛋白酶消化收集后,进行细胞计数,用新鲜的RPMI1640培养基稀释Eca9706至2×104个/mL,100μL/孔接种于96孔板,置于37℃,5%CO2的饱和湿度培养箱中培养,培养12h后,加入100μL制备好的大蒜素、大蒜素前药(5、10、15、20、30μg/mL)和4.8μg/mL的阳性对照DADS(DADS用DMSO配制成0.5mg/mL,置于4℃保存。临用前用新鲜RPMI1640培养液稀释至终质量浓度4.8μg/mL),阴性对照加入等体积的细胞培养液,空白对照组(无细胞)加入等体积PBS,用于调零,各组设3个重复孔。培养24、48、72h后,弃去各孔培养基,每孔加入20μL5mg/mLMTT溶液和80μL培养基,继续培养4h。弃去各孔残液,每孔加入二甲基亚砜100μL,置摇床上低速振荡30min,使结晶物充分溶解。用酶标仪检测490nm波长处测量各孔的吸光值(A490)。IC50的测定测定方法同MTT实验,根据不同质量浓度大蒜素及其前药处理食管癌细胞不同时间的增殖抑制率,计算出达到最大抑制率一半时所对应的大蒜素及其前药的质量浓度(IC50)。2.4实时定量rt-pcr检测分别收集经高、中、低质量浓度(10、20、40μg/mL)大蒜、大蒜素前药处理不同时间(24、48、72h)的Eca9706细胞,并用PBS清洗3次,加入1mLTrizol。用Trizol法提取Eca9706细胞的总RNA,进行cDNA反转录,按试剂盒说明书进行。实时定量RT-PCR检测采用Sybrgreen法,每一个样品同时进行β-actin和survivin、p53、bcl-2、bax、caspase-3基因的检测。总反应体系为25.0μL,其中SYBR荧光染料12.5μL,10μmol/mL上下游引物(表1)各1μL,cDNA(1μg/mL)模板1.5μL,补充ddH2O10μL,每一样本设3个复孔。95℃、3min变性后,共进行40个循环扩增,每一个循环包括95℃、10s,61℃、50s。从65℃到95℃,每隔0.5℃保持5s,记录一次荧光值,获得溶解曲线。所有样品检测均设置阴性对照(无模板)以排除假阳性。相对定量的计算方法:mRNA表达量变化=2-ΔΔCt,其中ΔΔCt=(处理样本目的基因Ct-处理样本内参基因Ct)-(对照样本目的基因Ct-对照样本内参基因Ct)。2.5统计分析每组实验重复3次,采用Prism软件对数据进行两因素方差分析和显著性检验;多组间参数采用单因素方差分析和多重比较。3结果与讨论3.1大蒜素及其前药对日进程中东南角相对单一的增殖抑制率的影响以4.8μg/mL二烯丙基二硫化物(DADS)为对照,用不同质量浓度的大蒜素和大蒜素前药处理Eca9706细胞24、48和72h,MTT比色法测定细胞的增殖抑制率(图2A,2B)。大蒜素及其前药处理24和48h均呈现出时间和剂量依赖性抑制食管癌细胞的增殖,而较高质量浓度的大蒜素及其前药(20、30μg/mL)处理72h未表现出剂量依赖,这是由于增殖抑制率已达到较高水平(94%以上)而滞长。大蒜素及其前药抑制Eca9706细胞增殖的最佳作用质量浓度为20μg/mL,最佳作用时间为48h,其抑制率分别达到94.5%和96.7%。20μg/mL大蒜素及其前药作用食管癌的抑制率(48和72h)与4.8μg/mLDADS接近。大蒜素前药处理Eca9706细胞24和48h的IC50均小于大蒜素(表2),大蒜素前药处理24h的IC50比大蒜素降低了46%。说明大蒜素前药抑制食管癌细胞的效果优于大蒜素。3.2抑制细胞凋亡p53基因的突变和高表达是多种癌症发生的重要因素,突变型的p53通过上调bcl-2和下调bax基因表达,阻止细胞色素c从线粒体中的释放,最终抑制癌细胞凋亡。本实验结果显示,低、中、高质量浓度大蒜素及其前药处理Eca9706细胞不同时间后,p53表达量均显著低于对照组(表3)。与对照组相比,低、中、高质量浓度大蒜素及其前药处理72h后p53基因表达量分别下降了24.2%、56.3%、82.6%和43.9%、65.1%、73.9%,呈现出剂量依赖性。大蒜素及其前药能导致Eca9706细胞中的p53基因下调,进而影响凋亡相关基因的表达,最终可引起食管癌细胞凋亡。3.3大蒜素及其前药在eca9706细胞中的表达Survivin是一种凋亡抑制基因,过度表达使细胞失去了正常增生周期中凋亡“开关”的限制,造成细胞增殖增加,凋亡减少,导致癌症的发生。不同质量浓度的大蒜素及其前药处理Eca9706细胞不同时间,survivin的表达量与对照组相比均有所下降(表4),说明大蒜素及其前药在转录水平上抑制了Eca9706细胞survivin的mR-NA表达,起到诱导癌细胞凋亡的作用。高质量浓度的大蒜素及其前药处理72h,survivin表达量显著降低,诱导癌细胞凋亡的作用较强,并且大蒜素前药的效果优于大蒜素。3.4不同浓度bcl-2和bax基因对eca9706细胞凋亡的影响bcl-2基因是一种原癌基因,它具有抑制细胞凋亡的作用。与对照组相比,不同质量浓度的大蒜素及其前药处理Eca9706细胞不同时间,bcl-2基因表达均呈现下调(表5)。中、高质量浓度的大蒜素及其前药处理24和72h,bcl-2基因表达下调较显著,说明它们能够通过下调bcl-2基因表达促进Eca9706细胞凋亡。bax为诱导凋亡基因,bax基因的高表达促进细胞凋亡。与对照组相比,不同质量浓度的大蒜素处理24h,bax基因上调表达极显著(表6),前药组呈现一定程度的上调,处理48和72hbax基因表达上调不显著,有些处理还表现出一定程度的下降。bcl-2家族成员的构成比例是凋亡调控的关键因素,其中bcl-2/bax比率是启动细胞凋亡的“分子开关”,当bcl-2/bax比率降低可诱导细胞凋亡。与对照组相比,不同质量浓度的大蒜素及其前药处理Eca9706细胞不同时间,bcl-2/bax比率均下降(表7)。低、中、高质量浓度的大蒜素及其前药处理Eca9706细胞24h,bcl-2/bax比率下降显著,分别比对照下降了76%、89%、93%和61%、69%、78%。大蒜素及其前药可能通过调控bcl-2/bax比率诱导食管癌细胞凋亡。3.5caspase-3表达增加半胱天冬酶(caspase)家族在介导细胞凋亡的过程中起着极其重要的作用,caspase-3是caspase级联“瀑布”下游凋亡程序的中心,阻断caspase-3的激活是许多药物发挥细胞保护作用的关键机制之一。不同质量浓度的大蒜素及其前药处理Eca9706细胞不同时间后,caspase-3表达均高于对照组(表8),并表现出剂量依赖性。中、高质量浓度的大蒜素及其前药处理24和48h时,caspase-3表达量升高显著(P<0.05)。大蒜素及其前药诱导caspase-3高表达的质量浓度为40μg/mL,最佳时间为48h。这些结果表明大蒜素及其前药能够通过上调caspase-3的表达,激活下游凋亡程序,促进食管癌细胞凋亡。4前药诱导的保护模式细胞增殖的失控是肿瘤细胞的基本生物学特征之一,大量的研究表明大蒜素能够抑制多种癌细胞的增殖,Oommen等人的研究表明,鼠纤维肉瘤细胞L-929、人结肠癌细胞SW480和人宫颈癌细胞HeLa随着大蒜素的质量浓度增加存活率降低。大蒜素呈剂量依赖性抑制胃癌SGC-7901细胞,高质量浓度的大蒜素(0.1mg/mL)处理48h抑制率达到89%。本实验也证实了大蒜素及其前药显著抑制食管癌细胞增殖,在大蒜素及其前药质量浓度为20μg/mL,处理时间为48h,其抑制率分别达到94.5%和96.7%。不同时间和剂量处理食管癌细胞均呈现出时间和剂量依赖型抑制癌细胞的增殖。大蒜素前药处理食管癌细胞(24和48h)的IC50小于大蒜素(表1),说明前药抑制食管癌细胞的效果优于大蒜素,这可能与前药相对于大蒜素较稳定有关。肿瘤的发生是多基因参与的复杂过程,涉及多个癌基因和抑癌基因的激活与失活。大蒜素能够诱导前列腺癌LNCaP细胞、小鼠黑色素瘤细胞B16-F1、人胃腺癌SGC-7901细胞株等癌细胞的凋亡。大蒜素诱导肿瘤细胞凋亡涉及到多种蛋白的作用,包括bcl-2家族、caspase家族、p53和survivin等。野生型的p53是一种抑癌基因,在细胞增殖、分化、DNA修复、细胞周期和凋亡中起重要的作用。p53基因突变失去了对细胞增殖的抑制,而且出现类似癌基因蛋白类的促细胞恶性转化的作用,在多种肿瘤细胞中都发现p53基因的突变或缺失。癌细胞中的突变型p53通过上调凋亡