微波辅助提取刺五加皮中的总黄酮

第1章绪论1.1微波提取技术1.1.1微波简介微波辅助提取，又被叫做微波提取（MAE），是由传统的溶剂萃取与微波连接而产生的全新提取方法。微波辅助提取法具备方便节能、省时省力、易操作、实验仪器简单等有利条件，其研究成果的实用价值大，具有远大的发展前景和空间。微波是指频率为300MHz-300GHz的电磁波，是无线电波中一个有限频带的简称，即波长在1毫米~1米之间的电磁波，是分米波、厘米波、毫米波、亚毫米波的统称。微波频率比一般的无线电波频率高，通常也称为“超高频电磁波”。微波作为一种电磁波也具有波粒二象性。1.1.2微波的产生微波能通常由直流电或50Hz交流电通过一特殊的器件来获得。可以产生微波的器件有许多种，但主要分为两大类：半导体器件和电真空器件。电真空器件是利用电子在真空中运动来完成能量变换的器件，或称之为电子管。在电真空器件中能产生大功率微波能量的有磁控管、多腔速调管、微波三、四极管、行波管等。在微波加热领域特别是工业应用中使用的主要是磁控管及速调管。1.1.3微波的各种机理热效应微波对生物体的热效应是指由微波引起的生物组织或系统受热而对生物体产生的生理影响。热效应主要是生物体内有极分子在微波高频电场的作用下反复快速取向转动而摩擦生热；体内离子在微波作用下振动也会将振动能量转化为热量；一般分子也会吸收微波能量后使热运动能量增加。如果生物体组织吸收的微波能量较少，它可借助自身的热调节系统通过血循环将吸收的微波能量(热量)散发至全身或体外。[1]如果微波功率很强，生物组织吸收的微波能量多于生物体所能散发的能量，则引起该部位体温升高。局部组织温度升高将产生一系列生理反应，如使局部血管扩张，并通过热调节系统使血循环加速，组织代谢增强，白细胞吞噬作用增强，促进病理产物的吸收和消散等。[2]非热效应微波的非热效应是指除热效应以外的其他效应，如电效应、磁效应及化学效应等。在微波电磁场的作用下，生物体内的一些分子将会产生变形和振动，使细胞膜功能受到影响，使细胞膜内外液体的电状况发生变化，引起生物作用的改变，进而可影响中枢神经系统等。[3]微波干扰生物电(如心电、脑电、肌电、神经传导电位、细胞活动膜电位等)的节律，会导致心脏活动、脑神经活动及内分泌活动等一系列障碍。对微波的非热效应，人们还了解的不很多。当生物体受强功率微波照射时，热效应是主要的(一般认为，功率密度在在10mW/cm2者多产生微热效应。且频率越高产生热效应的阈强度越低)；长期的低功率密度(1mW/cm2以下)微波辐射主要引起非热效应。[4]加热原理微波是频率在300MHz到300GHz的电波，被加热介质物料中的水分子是极性分子。它在快速变化的高频电磁场（微波）作用下，其极性取向将随着外电场的变化而变化。造成水分子的自旋运动的效应，此时微波场的场能转化为介质内的热能，使物料温度升高，产生热化等一系列物化过程而达到微波加热干燥的目的。杀菌机理微波杀菌是利用了电磁场的热效应和生物效应的共同作用的结果。微波对细菌的热效应是使蛋白质变化，使细菌失去营养，繁殖和生存的条件而死亡。[5]微波对细菌的生物效应是微波电场改变细胞膜断面的电位分布，影响细胞膜周围电子和离子浓度，从而改变细胞膜的通透性能，细菌因此营养不良，不能正常新陈代谢，细胞结构功能紊乱，生长发育受到抑制而死亡。此外，微波能使细菌正常生长和稳定遗传繁殖的核糖核酸[RNA]和脱氧核糖核酸[DNA]，是由若干氢键松弛，断裂和重组，从而诱发遗传基因突变，或染色体畸变甚至断裂。1.1.4微波辅助提取的特点目前，微波辅助提取在化工研究领域备受欢迎，主要是因其与一般的提取方法相比较，微波法更具有不可比拟的优势。下面主要介绍微波法的优点：提取速度快微波主要作用在待处理样品的偶极分子上，因其高频率产生的高微波能能够使偶极分子发生偶极涡流、高速摩擦以及离子传导，迅速产生巨大的热量，从而使溶剂分子快速地进入到待处理样品中，近而使萃取分离的成分更短时间地发生溶剂化，这非常有助于减少微波提取的时间。[6]选择性高任意一种化学物质的介电常数都是有差别的，导致任何一种物质对微波的吸收水平都有所差异，以至提取体系中的有些成分有选择的进行加热。一般来说，化合物对微波的吸收能力和化合物分子的极性有关，极性越大的溶剂分子和待萃取组分分子，对微波的吸收效果就会越好，反之，普通非极性分子基本上不能够对微波进行吸收，导致微波对其无任何的加热效果。所以能够通过选用适合的提取物质来增大提取效率。[7]易于控制微波辅助提取一般采用微波炉等设备即可进行，在其过程中不断改变微波时间、微波功率和加热速度等就可以合理地控制提取时间和提取速度。此过程操作简单，便于控制提取条件，近而增大提取效率。[8]节能高效微波设备的加热机制非常独特，能够使待处理样品受热均匀，不存在受热梯度。最重要的是，采用微波加热，热能量损失是极小的，这样大大的提高了能量转换效率。[9]安全环保微波的发射只需消耗电力，在该过程中不发生任何的化学反应，因此就不会产生有害气体和残渣等等。另外，微波辐射的时候并不能够残留馀下的热量，杂音和粉尘等污染。所以微波提取相对于其他提取方法是非常安全环保的。[10]1.1.5微波辐射辅助提取技术的应用在天然产物提取方面的应用天然产物中有效组分的提取一直以来就是一种浪费溶剂、消耗成本、消耗时间的研究。传统的索氏抽提法和热回流法都具备操作时间较长、有效成分耗损严重、提取率较低等弊端。为了适应时代进步的需求，微波辐射辅助技术在提取目标物质方面异军突起。[11]作为一种发展空间可观的方法，微波辐射辅助技术效率偏高、提取速度较快、提取时间较短。另外，采用微波辐射辅助提取技术中能够选取的溶剂非常多，还能够大大地降低溶剂消耗量。郭振库采用微波辐射技术有效分离了黄芩中的黄芩苷，并通过正交分析优化最佳条件。[12]在食品工业上的应用在食品工业中，传统的提取技术大多数都带有着各种各样的弊端，例如提取时间长、提取要求相对较高、产率较低低、操作过程复杂。采用微波辅助提取技术能够大范围地提取食物里的有效组分，并且能够减少待处理食品的提供量。微波辅助法应用于无挥发性食品里的有效物质，能够高效地加快有效物质的提取速度，并且不会破坏热敏性物质。[13]如运用微波辅助提取技术提取橘皮中的果胶，微波法提取时间可以降低至传统方法提取时间的2/3上下，耗费成本也相对降低、产品质量也更高。在传统中医药方面的应用在过去的几年里，微波辅助提取技术吸引了越来越多的关注，因为其具备较高提取效率，操作简单，精度高的特点。自该项技术兴起以来，微波辐射辅助提取技术在中医药方面应用的报道逐年增加。[14]因为微波的穿透力较大、选择性好、提取速度快等优点，它普遍运用于有效药物成分的提取、中医药材的干燥处理以及药膏的干燥处理。另外，微波对植物细胞内产物的提取具备充分且良好的选择功能，能够使其有效物质快速分离出来。[15]在分析化学方面的应用在20世纪70年代，Hawell等人采用微波设备对核材料进行了样品的前处理，微波技术逐渐进入了化工领域。与传统的提取技术相比，微波辅助提取技术的选择性较好、提取时间较短、能源消耗少、环境污染较小，这些优势使其得到了分析研究人员的重视。[16]在分析专业范畴内，微波技术基本上都被用于有效物的提取、样品前处理、产物中结晶水的测定等等。张萍利用微波消解法测定了花岗岩中的金属元素如铅、镉、砷、铬等，获得了令人满意的结果。1.2刺五加皮1.2.1刺五加皮简介刺五加皮（拉丁学名：Acanthopanaxsenticosus

(Rupr.Maxim.)Harms），别名：坎拐棒子、虎潦、一百针。灌木，高1-6米；分枝多。叶有小叶5，稀3；叶柄常疏生细刺，小叶片纸质，椭圆状倒卵形或长圆形，先端渐尖，基部阔楔形，上面粗糙，深绿色，脉上有粗毛，下面淡绿色，脉上有短柔毛，边缘有锐利重锯齿；小叶柄有棕色短柔毛。[17]伞形花序单个顶生，有花多数；总花梗无毛，花梗无毛或基部略有毛；花紫黄色；萼无毛；花瓣卵形；子房5室，花柱全部合生成柱状。果实球形或卵球形。花期6-7月，果期8-10月。分布于中国黑龙江、吉林、辽宁、河北和山西。生于山坡林中及路旁灌丛中，药圃常有栽培。1.2.2刺五加皮的药理作用刺五加皮在中国医药学中做为药物广泛应用已有悠久的历史，具有“补中益精、坚筋骨、强志意”的作用，久服“轻身耐老”，与它药配伍亦可“进饮食、健气力、不忘事”。另雷教著《炮炙论》记五加皮有“阳人使阴，阴人使阳”的作用。根皮祛风湿、强筋骨，泡酒制五加皮酒（或制成五加皮散）。根皮含挥发油、鞣质、棕桐酸、亚麻仁油酸、维生素A，B1。根皮亦可代“五加皮”，供药用；种子可榨油，制肥皂用。国外对人参及其近缘植物刺五加进行了较系统的研究，证明了刺五加和人参有相似的药理作用和临床疗效。[18]1.3黄酮类化合物1.3.1黄酮类化合物简介黄酮类化合物（flavonoids）是一类存在于自然界的、具有2-苯基色原酮（flavone）结构的化合物。它们分子中有一个酮式羰基，第一位上的氧原子具碱性，能与强酸成盐，其羟基衍生物多具黄色，故又称黄碱素或黄酮。黄酮类化合物在植物体中通常与糖结合成苷类，小部分以游离态（苷元）的形式存在。绝大多数植物体内都含有黄酮类化合物，它在植物的生长、发育、开花、结果以及抗菌防病等方起着重要的作用。[19]黄酮类化合物中有药用价值的化合物很多，如槐米中的芦丁和陈皮中的陈皮苷，能降低血管的脆性，及改善血管的通透性、降低血脂和胆固醇，用于防治老年高血压和脑溢血。由银杏叶制成的舒血宁片含有黄酮和双黄酮类，用于冠心病、心绞痛的治疗。全合成的乙氧黄酮又名心脉舒通或立可定，有扩张冠状血管、增加冠脉流量的作用。许多黄酮类成分具有止咳、祛痰、平喘、抗菌的活性。护肝，解肝毒、抗真菌、治疗急、慢性肝炎，肝硬化黄酮类化合物多为结晶性固体，少数为无定型粉末。[20]黄酮类化合物的颜色与分子中存在的交叉共轭体系及助色团（-OH、-CH3）等的类型、数目及取代位置有关。一般来说，黄酮、黄酮醇及其苷类多呈灰黄至黄色，查尔酮为黄色至橙黄色，而二氢黄酮、二氢黄酮醇、异黄酮类等因不存在共轭体系或共轭很少，故不显色。花色素及其苷元的颜色，因pH的不同而变，一般呈红（pH<7）、紫（7<8.5）、蓝（pH>8.5）等颜色。黄酮苷元一般难溶或不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚等有机溶剂，易溶于稀碱液。黄酮类化合物的羟基糖苷化后，水溶性相应加大，而在有机溶剂中的溶解度相应减少。黄酮苷一般易溶于水、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、吡啶等溶剂，难溶于乙醚、三氯甲烷、苯等有机溶剂。黄酮类化合物因分子中多有酚羟基而呈酸性，故可溶于碱性水溶液、吡啶、甲酰胺及二甲基甲酰胺中。有些黄酮类化合物在紫外光（254nm或365nm）下呈不同颜色的荧光，氨蒸汽或碳酸钠溶液处理后荧光更为明显。[21]多数黄酮类化合物可与铝盐、镁盐、铅盐或锆盐生成有色的络合物。1.3.2黄酮类化合物的生物活性黄酮类化合物分布广泛，具有多种生物活性。心血管系统活性。不少治疗冠心病有效的中成药均含黄酮类化合物，研究发现芦丁、槲皮素、葛根素以及人工合成的立可定（recordil）等均有明显的扩冠作用；槲皮素、芦丁、金丝桃苷、葛根素、灯盏花素、葛根总黄酮、银杏叶总黄酮对缺血性脑损伤有保护作用；金丝桃苷、水飞蓟素、木犀草素、沙棘总黄酮对心肌缺血性损伤有保护作用；银杏叶总黄酮、葛根素、大豆苷元等对心肌缺氧性损伤有明显保护作用。此外，沙棘总黄酮、苦参总黄酮、甘草黄酮（主要为甘草素和异甘草素）具有抗心律失常作用。抗菌及抗病毒活性。木犀草素、黄岑苷、黄岑素等均有一定的抗菌作用；槲皮素、二氢槲皮素、桑色素、山柰酚等具有抗病毒作用；从菊花、獐牙菜中分离得到的黄酮单体对HIV病毒有较强抑制作用，大豆苷元、染料木素、鸡豆黄素A对HIV病毒也有一定抑制作用。[22]抗肿瘤活性。黄酮类化合物的抗肿瘤机制多种多样，如槲皮素的抗肿瘤活性与其抗氧化作用、抑制相关酶的活性、降低肿瘤细胞耐药性、诱导肿瘤细胞凋亡及雌激素样作用等有关；水飞蓟素的抗肿瘤活性与其抗氧化作用、抑制相关酶活性、诱导细胞周期阻滞等有关。抗氧化自由基活性。大多数黄酮类化合物均有较强的抗氧化自由基作用，而黄酮类化合物的一些药理活性也往往与其抗氧化自由基相关。抗炎、镇痛活性。芦丁、羟基芦丁、二氢槲皮素等对角叉菜胶、5-HT及PGE诱发的大鼠足爪水肿、甲醛引起的关节炎及棉球肉芽肿等均有明显抑制作用；金荞麦中的双聚原矢车菊苷元有抗炎、解热、祛痰等作用；金丝桃苷、芦丁、槲皮素及银杏叶总黄酮等有良好的镇痛作用。[23]保肝活性。水飞蓟素对中毒性肝损伤、急慢性肝炎、肝硬化等有良好的治疗作用；淫羊藿黄酮、黄岑素、黄岑苷能抑制肝组织脂质过氧化、提高肝脏SOD活性、减少肝组织脂褐素形成，对肝脏有保护作用；甘草黄酮可保护乙醇所致肝细胞超微结构的损伤等。此外，大量研究表明黄酮类化合物还具有降压、降血脂、抗衰老、提高机体免疫力、泻下、镇咳、祛痰、解痉及抗变态等药理活性。1.3.3化合物的提取方法在自然界中黄酮类化合物品种繁多，目前经研究发现并已经分离出来的就达到9000多种。黄酮类化合物是植物重要的代谢产物，是一种自然的高活性成分，具备多种药用价值，受到来自世界各地的专家们深刻普遍的关注。经研究证实，黄酮类化合物不只具备降血脂、避免动脉硬化、清除自由基、降血压等成效，并且它在抗肿瘤、抗突变等方面医治效果也不能小觑。因此，如何从天然植物中分离黄酮类化合物，并对其进行深入的研究是极具社会价值的。索氏（Soxhlet）提取法索氏（Soxhlet）抽提法主要应用于准备检测样品中脂肪的量的定量分析。该方法提取过程方便，便于结果分析，但是由于该方法中提取过程处于静态且醇的蒸发处于上层，导致产物的提取率很低。另外，索氏（Soxhlet）抽提法的提取时间较长，消耗能量较大，这主要是因为在该方法中醇不断的加热、汽化、再冷凝，循环多次以达到提取较完全的状态。由于乙醇的汽化潜热相对较大，消耗成本较高，故而在工业领域大型生产中一般不采用索氏（Soxhlet）抽提法。然而，索氏（Soxhlet）抽提法在小型实验中却是一个不错地选择，如刘怀坤[等人采用不同的方法来提取分离银杏叶里黄酮类化合物，发现索氏抽提法最为适宜。回流热提取法回流热提取法通常用合适的溶剂分离待提取的组分，所选溶剂必须高度挥发，然后在加热状态下蒸馏提取，有机溶剂镏出后再经冷凝镏回原容器中，以上过程频繁进行数次，并最终可以提取所有要提取的组分。采用传统回流法所得到的类黄酮产量相对偏高，因此，在提取黄酮类化合物方面利用此方法偏多一些。例如朱红等人通过溶剂回流加热的方式提取了甘薯叶中的黄酮类化合物，并用正交法明确了其最佳工的艺条件。膜分离法自膜分离法兴盛起来，就被看作是拥有长远未来的一种方法。曾有研究人员预测，膜分离技术因其节省成本、产率高的特点很可能替代传统的分离方法，这将大大地推动社会发展，促进科学进步。膜分离技术将会在天然植物有效组分的分离方面得到重大进展。正如郭巍就采用膜分离法分离纯化藤茶中类黄酮物质。大孔树脂吸附法大孔树脂吸附法自1970年兴起之后，就迅速地发展着。该方法利用大孔吸附树脂来吸附待分离纯化物质以得到提取分离的最佳成效。大孔吸附树脂是一系列合成高分子吸附剂，具有立体多孔结构，可用表面积巨大，近而导致其吸附能力变强。该分离方法主要用来提取药物和天然植物中内酯、皂苷、生物碱、黄酮等活性较高的成分。如鲁桂华等人利用大孔树脂吸附法提取纯化新疆大叶补血草根茎中的黄酮类化合物。采用大孔吸附树脂分离法进行分离提取，该方法具有设施相对简略，能耗低，分离效果好，选择性高的的优点，是一种有发展的分离纯化方法。超声提取法超声提取法主要采用超声波辐射能量来提高待提取成分的产率和含量。在过去的几年中，许多文献集中提到对植物，生物碱，生物活性物质提取等方面的使用研究，这些研究发现，在较低能耗的超声提取法中，有效成分会得到较好的保护，提取率也会有大幅度的提升。正如王菲和吕萍等人都运用超声波法得到白花菜和玉米须中黄酮类化合物，并用响应面曲线法或正交法将其提取条件进行优化。超声波辅助提取技术在有效地提取天然药物中黄酮类化合物的同时具备提取率高、耗时较短（通常1h之内）、能耗低、相对环保、提取温度较低、适合工业生产等特点。1.4课题研究的意义和主要内容刺五加为五加科植物刺五加的干燥根及根茎，其茎、叶也可作药用，具有益气健脾、补肾安神的功能川。主要分布于我国东北、华北及陕西、四川、广西等地。近年研究表明，刺五加叶中含有丰富的皂昔类、黄酮类化合物，可进一步开发利用。黄酮类化合物分布广泛，种类繁多，生物活性多样，具有降压，降血糖，镇痛，抑制血小板聚集，抗骨质疏松，抗心律失常，抗过敏及抗缺氧等多种药理和保健作用。而且黄酮类化合物在人体内不能直接合成，只能从食物中获得，所以近些年学者们都在积极关注从植物中提取纯度高，活性强的天然黄酮成分。本课题采用微波法提取刺五加皮中黄酮类化合物，用该方法提取黄酮类化合物不仅对提取物具有较高的选择性，还可以有效的保护药用植物中的有效成分。从而大大的提高了产率，缩短提取时间，做到低能耗且无污染。在本研究中，利用微波辅助提取技术从刺五加皮中提取总黄酮。考察了微波功率、料液比、微波辐射时间、乙醇体积分数等因素对黄酮提取率的影响。正交法根据黄酮类化合物提取率和这些独立因素之间的关系，来优化黄酮类化合物的提取条件。

第2章实验部分2.1实验仪器及主要试剂2.1.1实验仪器实验所需仪器见表2-1：表2-1实验仪器仪器名称型号产地紫外/可见分光光度计TU-1901北京普析通用仪器有限公司格兰仕微波炉P70D20TJ-D3佛山市顺德区格兰仕微波炉电器有限公司200克多功能粉碎机Xs-04广州华凯电子科技有限公司玻璃仪器气流烘干器KQ-B河南省巩义市英峪予华仪器有限公司电子分析天平FA2004上海精科天平2.1.2实验主要试剂及药品实验所用的刺五加皮购于广西。实验所需要的试剂及药品见表2-2。表2-2实验试剂及药品药品名称级别产地乙醇（CH3CH2OH）分析纯天津市科密欧科技有限公司氢氧化钠（NaOH）分析纯天津市凯通化学试剂有限公司硝酸铝（Al（NO3）3）分析纯天津市凯通化学试剂有限公司亚硝酸钠（NaNO2）分析纯天津市凯通化学试剂有限公司2.2实验过程2.2.1标准曲线的建立本实验采用紫外分光光度法测定刺五加皮中黄酮提取率，以芦丁作为标准物质绘制标准曲线。分光光度法原理分析实验采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法测定总黄酮：黄酮类化合物本身特有的吸收峰出现在紫外光区范围内，其中一个特征峰的波长为320-380nm，这和肉桂酰类物质的特征峰相似，另外一个特征峰波长为240-270nm，这和苯甲酰环类化合物的特征峰相似。当亚硝酸盐存在时，B环上的邻苯二羟基能够在一定的碱性环境中和Al(NO3)3反应，产生黄色的黄铜铝聚合物，在一定的吸收波长下有最大吸收峰，可引起相应吸收带红移，从而排除刺五加皮含有的具有相同吸收的杂质的干扰。本实验中使用芦丁为标准参照物。精确移取6mL芦丁标准溶液，按照标准曲线下进行显色反应，以将70%乙醇溶液为参比，于400~550nm波长位置扫描，如图2-1所示，芦丁溶液在λ=505.0nm处出现最大的吸收，故选择505.0nm为测定最大吸收波长。图2-1最大吸收波长标准曲线精密准确称取干燥至恒重的芦丁标准物0.2000g，置于100mL容量瓶中，加乙醇70mL，置于超声波清洗仪中超声使其溶解，冷却至室温，加乙醇至刻度，摇匀。精密吸取标准溶液0mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL置于25mL容量瓶中，加5%亚硝酸钠1.0mL，摇匀，静置6分钟，加10%硝酸铝1.0mL，摇匀，静置6分钟，加4%氢氧化钠5.0mL，摇匀，加乙醇至刻度，摇匀，静置15分钟后，以乙醇做参比，用1cm的玻璃比色皿在最大吸收波长505nm处用紫外分光光度计测定吸光度值，如图2-1所示。以吸光度值（A）为纵坐标，以芦丁标准溶液的浓度（µg/mL）为横坐标绘制标准曲线，如图2-2所示。由芦丁标准曲线图2-1可知：浓度在8.00~80.00μg/mL线性关系良好，线性回归方程为Y=0.01194C+0.00299，r=0.9998。图2-2乙醇-芦丁标准曲线2.2.2提取流程取0.2000g刺五加皮于锥形瓶中，按一定比例加入乙醇，搅拌均匀，放入微波中，设置温度处理一段时间，过滤得滤液，显色，分光光度计测定含量；实验流程图:刺五加皮粉末→加入乙醇→微波提取→过滤→显色→分光光度计测含量2.2.3微波提取黄酮类化合物的单因素实验功率对黄酮类化合物提取率的影响实验准确称取粉碎度为60~80目的刺五加皮粉0.2000g置于5个锥形瓶中，以60%乙醇为溶剂，料液比为1:50（g/mL），提取时间1.5min，功率分别在119W、159W、280W、462W、595W的条件下进行提取，过滤，所得滤液分别置于25mL比色管中，加入乙醇至25mL定容，摇匀，即得黄酮类化合物样品试液，按2.2.1方法于最大吸收波长505nm处用紫外分光光度计测定吸光度。提取剂浓度对黄酮类化合物提取率的影响实验准确称取粉碎度为60~80目的刺五加皮粉0.2000g置于5个锥形瓶中，溶剂分别用30%乙醇、40%乙醇、50%乙醇、60%乙醇、70%乙醇，在料液比为1:60（g/mL），提取时间为1.5min，温度30℃，功率为280W的条件下进行提取，过滤，所得滤液分别置于25mL比色管中，加入乙醇至25mL定容，摇匀，即得黄酮类化合物样品试液，按2.2.1方法于最大吸收波长505nm处用紫外分光光度计测定吸光度。料液比对黄酮类化合物提取率的影响实验准确称取粉碎度为60~80目的刺五加皮粉0.2000g置于5个锥形瓶中，以60%乙醇为溶剂，提取时间为1.5min，功率为280W，料液比分别在1:30、1:40、1:50、1:60、1:70（g/mL）的条件下进行提取，过滤，所得滤液分别置于25mL比色管中，加入乙醇至25mL定容，摇匀，即得黄酮类化合物样品试液，按2.2.1方法于最大吸收波长505nm处用紫外分光光度计测定吸光度。提取时间对黄酮类化合物提取率的影响实验准确称取粉碎度为60~80目的刺五加皮粉0.2000g置于5个锥形瓶中，以60%乙醇为溶剂，料液比为1:50（g/mL），功率为280W，提取时间分别0.5分钟、1钟、1.5分钟、2分钟、2.5分钟的条件下进行提取，过滤，所得滤液分别置于25mL比色管中，加入乙醇至25mL定容，摇匀，即得黄酮类化合物样品试液，取10mL于另一比色管中，加5%亚硝酸钠1.0mL，摇匀，静置6分钟，加10%硝酸铝1.0mL，摇匀，静置6分钟，加4%氢氧化钠10.0mL，摇匀，加乙醇至刻度，摇匀，静置15分钟后，以乙醇做参比，用1cm的玻璃比色皿在最大吸收波长505nm处用紫外分光光度计测定吸光度值于最大吸收波长505nm处用紫外分光光度计测定吸光度。2.2.4正交实验准确称取粉碎度为60~80目的刺五加皮粉0.2000g，以乙醇为溶剂，在功率为280W的条件下，以料液比（A）、溶剂浓度（B）、提取时间（C）为考察因素，每个因素各取3个水平，在平行操作条件下，进行三水平正交实验。实验方案见表2-3所示。表2-3L9（33）正交实验因素和水平表水平料液比/g/mL溶剂浓度/%提取时间/min11：4040%1.521：5050%231：6060%精密度实验微波辐射提取黄酮类化合物时，由于操作误差的存在，每次测样所得的结果存在一定的差异。因此，需要对实验的重现性进行考察。按正交实验所得的最佳提取工艺条件，以提取率为考察目标平行提取5个试样，对测试结果计算标准偏差及相对标准偏差。公式如下：2.2.6加标回收率实验微波辐射提取黄酮类化合物时，只有在较高的准确度条件下，才能保证所测结果的准确性，因此可以通过回收率实验来考察该方法的准确度。准确准确称取60~80目的刺五加皮0.2000g置于6个250mL锥形瓶中，向六个锥形瓶中分别加入2µg·mL-1标准芦丁溶液0mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL，以50%乙醇为溶剂，在料液比为1：60（g/mL），提取时间为2min，功率为280W的条件下进行提取，过滤，所得滤液分别置于25mL比色管中，加入乙醇定容至20mL,摇匀，即得总黄酮样品试液，按2.2.1方法于最大吸收波长505nm处用紫外分光光度计测定吸光度。第3章结果与讨论3.1单因素实验结果3.1.1微波功率对黄酮类化合物提取率的影响按方法，功率对黄酮类化合物提取率的影响结果见表3-1和图3-1。表3-1微波功率对黄酮类化合物提取率的影响微波功率/W119259280462595提取含量/mg/g6.958.578.998.457.94图3-1微波功率与黄酮类化合物提取率的关系图实验数据表明：随着微波功率的增加黄酮类化合物的提取率不断增加，在50W达到最大值。这主要是因为黄酮类化合物为刺五加皮细胞中的次生代谢产物，存在于防风细胞的液泡中，通过破坏防风的细胞壁和细胞膜，也就使黄酮类化合物更易于被提取出来口，微波功率越大，越能有效的破坏原料的细胞壁，使得黄酮类化合物充分溶出。但是随着功率的加大，其影响作用将会变小。3.1.2乙醇浓度对黄酮类化合物提取率的影响黄酮类化合物是黄酮类化合物类物质，该类物质的提取大多采用乙醇做溶剂，本实验探讨乙醇浓度对黄酮类化合物提取率的影响。按方法，乙醇浓度对黄酮类化合物提取率的影响结果见表3-2和图3-2。表3-2乙醇浓度对黄酮类化合物提取率的影响乙醇浓度30%40%50%60%70%提取含量/mg/g8.2611.6510.678.946.38实验数据表明：当乙醇浓度为40%以下时，总黄酮含量随乙醇浓度的提高而增大；当乙醇浓度为60%时，总黄酮含量达到最大；当乙醇浓度大于40%，提取率下降。因为当乙醇浓度增大时，黄酮类化合物的浸出量增加，提取率也提高，但乙醇浓度的增加，也使部分水溶性黄酮类化合物溶出量降低，从而使得总黄酮量的提取率降低，所以选择40%乙醇溶液为最佳提取剂。图3-2乙醇浓度与黄酮类化合物提取率的关系图3.1.3料液比对黄酮类化合物提取率的影响按方法，料液比对黄酮类化合物提取率的影响结果见表3-3和图3-3。表3-3料液比对黄酮类化合物提取率的影响料液比/g/mL1:301:401:501:601:70提取含量/mg/g11.4411.9612.8613.3612.38实验数据表明：料液比达1:60（g/mL）时黄酮类化合物提取率达最大值。证明此时刺五加皮中的黄酮类化合物已全部被溶解出来；理论上，达到一定料液比时，随着料液比增大，溶解出的黄酮类化合物不变，黄酮类化合物提取率应该为恒值。但在整个提取过程中总会有原料和成品的损失，所以黄酮类化合物提取率在料液比大于1:60（g/mL）时有下降趋势。因此，在提取过程中只有选择合适比例的料液比，黄酮类化合物才会充分溶解。图3-3料液比与黄酮类化合物提取率的关系图3.1.4提取时间对黄酮类化合物提取率的影响按方法，提取时间对黄酮类化合物提取率的影响结果见表3-4和图3-4。表3-4提取时间对黄酮类化合物提取率的影响时间/min0.511.522.5提取含量/mg/g12.9113.8315.6513.1512.04图3-4提取时间与黄酮类化合物提取率的关系图实验数据表明：提取时间小于1.5min时，随着时间的增加，黄酮类化合物提取率不断增加，但提取时间大于1.5min时，随着提取时间的延长，黄酮类化合物的提取率反而有下降的趋势。超声时间越长，理想上应该获得更高的提取率，但在长时间的微波作用下，原料会被粉碎成较细的颗粒而穿透滤布（纸），造成损失。同时黄酮类化合物被氧化（时间越长黄酮类化合物被氧化的量就越大）。3.2正交实验结果上述单因素实验结果表明微波法提取刺五加皮中的黄酮类化合物的工艺条件为溶剂为浓度50%的乙醇，料液比1:50（g/mL），提取时间1.5min，微波功率为280W。其中溶剂浓度、料液比和提取时间对提取率影响较大，因此对这三个因素继续进行正交实验。根据刺五加皮有效成份及所含物质的理化性质，经过摸索比较，以刺五加皮中黄酮类化合物提取率为考察指标，在单因素实验基础上采用L9（33）正交表安排实验，进一步考察微波法提取黄酮类化合物的最佳工艺条件，实验结果见表3-5。通过表3-5数据处理得出最佳实验条件为A3B2C3：乙醇浓度为50%，料液比为1:60（g/mL），提取时间为2min，。与单因素实验结果不尽相同。可能原因是正交实验为各项因素协作影响的结果。由极差R的数据可见；各因素对提取效果的影响依次为：提取时间>料液比>溶剂浓度。由以上单因素实验和正交实验得出了微声波辐射提取刺五加皮中黄酮类化合物的最佳提取工艺条件，即刺五加皮0.2000g，粉碎度60~80目，50%乙醇做溶剂，料液比为1:60（g/mL），提取时间为2min，超声功率为280W。表3-5L9（33）正交实验设计结果序号A料液比/g/mLB提取剂浓度/%D提取时间/min提取含量/mg/g11：4040%114.1221：4050%1.513.8831：4060%214.1541：5040%1.514.4651：5050%216.1161：5060%113.5971：6040%215.0781：6050%114.6291：6060%1.515.25k114.0514.5514.11k214.7214.8714.53k314.9814.3315.11R0.930.541.003.3精密度实验结果微波辐射提取黄酮类化合物时，由于操作误差的存在，每次测样所得的结果存在一定的差异。因此，需要对实验的重现性进行考察。按2.2.5方法在最佳提取工艺条件下所得精密度实验数据如表3-6所示。表3-6精密度实验数据编号提取含量/mg/g平均值/mg/g标准偏差/mg/g相对标准偏差/%116.78216.38316.1716.510.231.4416.75516.46从表3-6中可以看出，同一黄酮类化合物样品五次不同进样所得到的平均提取含量为16.51mg/g，相对标准偏差为为1.4%，精密度较高。3.4加标回收率实验结果微波辅助提取黄酮类化合物时，只有在较高的准确度条件下，才能保证所测结果的准确性，因此可以通过回收率实验来考察该方法的准确度。按2.2.6方法所得回收率实验数据如表3-7所示。表3-7回收率实验数据加入标准芦丁的浓度/µg·mL-1理论值/µg·mL-1测量值/µg·mL-1回收率/%平均回收率/%0.0050.66250.6621.0054.53653.694101.572.0056.97856.894100.1599.773.0059.67360.09499.304.0063.21163.29499.875.0065.14866.49497.98从表3-7所示实验数据可以看出，回收率在97.98%101.57%之间的平均值为99.77%。由此说明该方法测得的结果较为准确。3.5其他样品含量的测量为了探究不同产地的刺五加皮中所含的黄铜含量是否相同，因此在以上精密度的最佳提取工艺条件下（微波功率为280W,乙醇体积分数为50%，料液比为1：60，提取时间为2min）,提取了10余种其他地方所产的刺五加，实验数据如表3-7结果如下：表3-8其他样品含量测定的实验数据编号提取含量/mg/g平均值/mg/g19.46220.78322.9648.0956789108.674.8710.0713.337.1516.3612.17实验结果表明，不同产地的刺五加皮中所含的黄酮量是不一样的，其产生的原因是由于地区温度的差异，其所处环境不同而导致的。结论本实验利用常压微波辐射法提取刺五加皮中的黄酮类化合物，并通过分光光度法确定刺五加皮中总黄酮的浓度，近而计算含量，得出提取率。实验综合讨论了影响提取含量的各个主要因素，确定了最佳的微波辐射法提取次五加皮中总黄酮的最佳提取工艺条件，并且在最佳提取条件下，实施精密度实验。经分析得到如下结论：（1）本课题以刺五加皮中黄酮类化合物的提取含量为指标，对刺五加皮中总黄酮常压微波辐射提取工艺进行探究。单因素实验主要考察了料液比、提取剂浓度、微波功率、微波辐射时间等因素对次五加皮中黄酮类化合物含量的影响。采用3因素（提取剂体积分数、料液比、微波时间）3水平正交实验法对其提取工艺进行优化。（2）最佳的提取条件为：微波功率为280W，料液比为1：60g/mL，乙醇体积分数为50%，微波时间为2min。精密度实验标准偏差S为0.23g/mg，相对标准偏差RSD为1.4%（n=5）。（3）实验过程和结果充分表明微波辐射法对提取刺五加中的总黄酮有极强的促进作用，而且使用溶剂少，反应迅速，产率高。微波辐射法是一种拥有高含量，且反应时间短，节约能源的绿色环保好方法，值得更进一步的研究开发及推广使用[16]。该方法不仅在理论上是一个很好的研究课题，而且可以预见在未来的工业生产中将具有广泛的应用前景，有待在天然产物提取的研究着中进一步扩大规模及不断应用。

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