利用酸性蛋白酶分离鸡体内的蛋鸡花青素

利用酸性蛋白酶分离鸡体内的蛋鸡花青素

乌骨鸡是世界上罕见的珍稀鸟类。它集药物、补充和营养于一体。对人体具有特殊的营养功能，可以调节身体的生理机能，提高身体的竞争力。乌骨鸡与普通鸡最明显的差异就是黑色素。研究表明乌骨鸡中的黑色素具有保护功效,可以避免紫外线引起的急慢性改变,具有清除自由基抗氧化等功能,从而可以预防癌症、抗衰老、提高肌体的免疫力。由于乌骨鸡黑色素与蛋白质结合在一起,对于乌骨鸡黑色素的分离,目前主要采用盐酸降解蛋白质的方法分离提取,其它方法几乎未见报道,但是该法可能造成黑色素形态和化学结构的损伤。因此,本实验拟采用蛋白酶法分离黑色素,旨在找出酶法分离乌骨鸡黑色素的最佳条件,为乌骨鸡产品开发提供服务。1材料和方法1.1蛋白酶和果汁试剂供试材料。泰和乌骨鸡,购自江西省泰和县生物谷食品科技工业园。酶制剂。537酸性蛋白酶、1398中性蛋白酶、HAP碱性蛋白酶(酶活力≥10万IU,上海酶制剂厂);木瓜蛋白酶(酶活力≥6000万IU,国药集团化学试剂有限公司)。使用化学试剂均为分析纯。1.2乌骨鸡黑色素提取工艺乌骨鸡→屠宰净毛→清洗→剔骨取肉→绞碎→加酶、调pH、恒温水解→酶水解液→离心→滤渣→清洗→黑色素。1.3确定最佳酶解工艺条件取全净膛乌骨鸡,剔骨取肉绞碎混匀,称取一定量鸡肉进行酶解实验,根据水解液中氨基态氮含量确定试验用酶种类。采用黄金分割法,依据水解液中氨基态氮含量确定最佳酶解工艺条件。酶解后将水解液离心(5000r/min,20min),沉淀物用醚、蒸馏水反复洗涤(至少4次),经真空冷冻干燥得黑色素。1.4氨基氮的测定采用电位滴定法检测。2结果与分析2.1激素的取得取一定量乌鸡肉按固液比肉水比1∶2,加入蛋白酶,在其最适pH和温度下水解乌鸡肉,每隔2h取样测定水解液中氨基态氮含量,并将水解液按黑色素分离方法取得黑色素。以氨基态氮含量为横坐标,其对应的黑色素重量(g)为纵坐标,利用EXCELL软件,进行线性回归分析,其回归方程和相关系数分别为:Y=0.0381X+0.0084,R=0.9939从图1中我们可以看出乌鸡肉中黑色素重量与水解液中氨基态氮含量成高度线性相关,其相关系数值达0.9939,因此,为了研究方便,我们采用水解液中氨基态氮含量来间接表示乌鸡肉中的黑色素的含量。2.2乌鸡肉水解蛋白质的活性比较选用537酸性蛋白酶、1398中性蛋白酶、HAP碱蛋白酶、木瓜蛋白酶4种蛋白酶,按肉水比(乌鸡肉∶水=1∶4,酶解时间4h,酶用量(相对乌鸡肉重)2%,在各自的适宜反应条件下,水解乌鸡肉,测定水解液中氨基态氮含量,结果见表1。由表1可知,4种蛋白酶对乌鸡蛋白质的水解效果不同,537酸性蛋白酶和木瓜蛋白酶对乌鸡肉有较强的水解能力,分别达到0.2644g/100ml、0.2403g/100ml;1398中性蛋白酶次之,为0.1272g/100ml;HAP碱性蛋白酶水解能力最差,只有0.0565g/100ml。由于酸性蛋白酶酶解条件温和(30~50℃),便于水解操作,因而我们选择537酸性蛋白酶作为水解乌鸡肉蛋白质用酶。2.3酶解条件的确定2.3.1加酶量的确定取pH3.0,温度40℃,固液比1∶4,酶解时间4h,实验结果见表2。由表2可知,在固定底物下,氨基态氮含量随加酶量的增加而增加,但加酶量增加到3.8%以后,氨基态氮含量不再增加,说明底物可能已被酶饱和,再增加酶量,也不会增加氨基态氮产量,相反,可能会导致酶分子之间的相互水解,因而加酶量可确定为3.8%。2.3.2不同黄金分割法酶解温度的确定各种酶都有各自热稳定性和最适作用温度,已知酸性蛋白酶作用范围在30~50℃,在加酶量3.8%,pH2.0,固液比(肉∶水)1∶4,酶解时间4h下,根据黄金分割法在30~50℃的含优区间内,找出最佳酶解温度。各试验点温度及水解结果见表3。从表3可知,温度为34.8℃为最佳酶解温度。2.3.3ph值的测定酸性蛋白酶在pH2.0~4.0时稳定,超过此范围,失活较严重,由黄金分割法,在pH2.0~4.0含优区间内找出最适pH,经实验测得最适pH=2.8(表4),另外,需注意的是,由于试验中随着蛋白质水解和氨基酸逐渐溶出,水解液中酸度会逐渐下降,因此需在酶水解过程中不断补充酸液,以维持水解体系中pH值基本不变。2.3.4氨基态氮含量对水解能力的影响酸性蛋白酶水解乌鸡肉,在相同条件下,底物浓度不同,其水解效果亦有差异。由表5结果可知,固液比为1∶2时,氨基态氮含量最多,水解能力最强,而超过这一值时,水解能力均降低。当底物浓度增大时黏度也增大,影响酶分子的扩散和定向,不利于酶与底物充分接触,因而酶水解能力降低;另一方面,底物浓度减小,则影响了酶与底物的接触频率。所以底物浓度过大过小都不利于酶水解。因此,固液比采用1∶2为宜。2.3.5不同浓度和添加5对乌鸡肉的水解结果在相同酶用量下,进行一次性加入,分两次加入进行酶解实验,酶解条件为:pH2.8,温度34.8℃,固液比(肉∶水)=1∶2,水解时间4h,其实验结果详见表6。从表6可以看出,在不增加酶用量的情况下,分两次加入537酸性蛋白酶对乌鸡肉进行水解,效果比一次性投入更加理想;而采用混合酶制剂效果优于单一酶制剂。分析认为,当底物浓度一定时,加酶量过大,可能导致酶本身相互水解,使酶活力降低,分次加入酶可以增强酶的活性,故水解的效果较好。2.3.6不同时间时间对水解液氨基氮的影响取10g乌鸡肉,加入0.38g537酸性蛋白酶和20g水。调节pH2.8置大烧杯中,放入34.8℃的恒温锅中进行酶解,每隔2h测定其水解液中氨基氮含量,其结果见图2。从图2中可以看出,在0~20h之间,随着酶解时间的延长,水解液中氨基态氮呈上升趋势,当达到20h时,水解液中氨基态氮含量最高,达0.4736g/100ml,水解能力最强,20h以后水解液中氨基态氮含量几乎不再增加,这可能与酶的活性下降有关。因而,可选定酶解时间为20h。2.4不同盐酸降解蛋白质法提取从鸡氧化酶按照上述酶解最佳工艺,提取出黑色素;同时我们也参照刘望夷的盐酸降解蛋白质法对泰和乌鸡黑色素进行提取,得到两者的提取率分别为:0.36%,0.30%,盐酸法分离出黑色素重量低于蛋白酶法,这可能与酶法提取黑色素损失小或未受损伤有关。3酸性蛋白酶