乌骨鸡花青素的生理功能研究进展

乌骨鸡花青素的生理功能研究进展

乌骨鸡，又名乌鸦和泰田鸡，属于鸟科、鸡科和鸡科。它的起源是江西省泰和县武山县。到目前为止，它已经提供了2000多年的饲养历史，现在在江西、浙江、陕西、四川、云南和贵州等省也有分布。乌鸡具有乌皮、乌骨、乌肉等十大特征,被传统医学认为是我国特有的具有药食两用的鸡种。现代医学研究表明,乌鸡的药用价值主要在于其体内存在的黑色素物质,乌鸡黑色素是滋阴益气、强身健体、抗衰防老、颐养天年的物质基础,药用价值很高。近年来,国内外学者对乌骨鸡黑色素开展了更加广泛和深入的研究,本文综述了乌骨鸡黑色素结构特征、理化性质、生理功能、生物合成途径及分布规律、分离提取方法等方面的研究成果,以期为今后的相关研究工作提供参考。1依结果的表面形态分类黑色素(Melanin)包括天然的黑色素与合成的黑色素。天然的黑色素一般分三类:第一类是真黑色素(Eumelanin),呈棕色、暗棕甚至黑色,主要存在于家禽黑羽或兰羽、眼、皮肤以及相关的组织中;第二类是脱黑色素(Pheomelanin),呈红色、棕色或黄褐色,多分布于家禽红棕色、浅黄色羽毛等组织以及红头发和蓝眼睛中;第三类是异黑色素(Allomelanin),呈棕色或黑色,主要存在于植物中。天然黑色素按来源又可分为植物源黑色素、动物源黑色素和微生物源黑色素三大类。其中真黑色素和脱黑色素主要存在于动物中,乌骨鸡黑色素属于真黑色素,主要分布于乌鸡的羽毛、皮肤、骨骼和肌肉中。2乌骨鸡黑色素的结构特征和理化性质2.1乌骨鸡嘴唇由重金属或苯磺酸钠提取80年代初以来,国内外许多学者为探明乌骨鸡黑色素的结构特征和理化性质已开展了大量的研究工作。研究表明:黑色素是一类与蛋白质结合牢固、不溶于水和几乎所有溶剂的、理化性质比较稳定的、呈无定形状态的吲哚类多聚体颗粒。另外,黑色素来源不同,其结构特征也存在一定差异。由于乌骨鸡黑色素常与蛋白质牢固结合,并且在可见光、紫外光下没有特殊吸收,所以一般选用X-射线衍射法,红外光谱法(IR)、电子光谱学化学分析法(ESCR)、电子顺磁共振波谱法(EPR)等仪器分析方法对其结构进行研究。目前,国内外对黑色素的详细结构虽然还没有真正弄清楚,但已取得一定的成果:已知多数乌鸡黑色素都是吲哚型的不规则高聚物,其分子中自由基的含量较高,还包括一些不定量的其它途径合成的吲哚类前体物质。吲哚区在范德华力作用下彼此重叠,由X-射线衍射分析,重叠的层与层间距为3.4A,但其它一些成份的不规则插入使一些多聚物区域形态不定。袁缨等通过分析乌骨鸡黑色素主要元素含量及电子能谱和红外光谱特征,推测其可能是一种以吲哚环为主体,周围连接其他一些芳香烃或烯烃类及羧基等基团的化合物,并通过硫、氮含量比较推测乌骨鸡黑色素可能是真黑色素;乌骨鸡黑色素的EPR波谱为轻微不对称的典型的单线一次微商波谱,无超细结构,其报道与Reedy、Muroya的研究结果基本一致。Reedy等和Muroya等用红外光谱分析法研究进一步表明:丝毛乌骨鸡卵巢和睾丸的特征光谱不同于骨膜和羽毛中的光谱,其差异在于含硫量的不同,这可能是由于黑素分子在某些器官有特化因子促使黑色素细胞合成浅黑色素,也提示乌骨鸡不同部位的黑色素结构可能存在差异。涂勇刚等利用紫外-可见光谱和红外光谱对酶法提取的泰和乌骨鸡黑色素进行光谱性质研究发现,泰和乌鸡黑色素在紫外和可见区无明显的吸收峰,但在200-400nm之间呈现吸光值迅速增加的特征;红外光谱图表明乌鸡黑色素分子结构中含有典型的苯醌类结构、典型的吲哚结构和脂肪族结构,这一发现与Brideli、Stainsack、Bilinska的研究结果一致。涂勇刚等通过高效液相色谱-质谱联用法(HPLC-MS)分析了乌骨鸡黑色素氧化降解产物,证实了乌骨鸡黑色素为真黑色素。涂勇刚等通过电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-AES)分析发现泰和乌骨鸡黑色素分子中含有Fe、Ca、Mg和Zn等多种金属元素,这表明表明黑色素对金属离子有富集作用;而黑色素对金属元素的富集作用可能与其结构中存在的胺基、羟基、羰基等基团有关,这又为进一步研究黑色素结构提供了一定的理论依据。2.2金属离子水溶液乌鸡黑色素理化性质研究表明:乌鸡黑色素物理化学性质比较稳定,在常温下难溶于水和常见的有机溶剂,对金属离子有很强的亲和力,具有电子自旋性。涂勇刚等利用紫外-可见光谱、红外光谱和分光光度法对酶法提取的泰和乌骨鸡黑色素进行光谱性质和稳定性研究,结果也证实了泰和乌骨鸡黑色素具有稳定的理化性质。3乌骨鸡的食用药用价值乌骨鸡是传统中医药的药用鸡,乌骨鸡入药效果与其皮、肉、骨中的黑色程度深浅有关,颜色愈深,药效愈佳。现代医学也认为,乌骨鸡的食用与药用价值主要在于其体内的黑色素物质。国内外学者对乌骨鸡黑色素的生理功能研究表明,黑色素具有延缓衰老、清除自由基、抗氧化、抗诱变、抗紫外线、抑制流感病毒等多种生理功能[16,17,18,19,20,21]。3.1复配的酶活性辜清等给老年小鼠饲喂泰和乌骨鸡及其黑色素,45天后应用酶组织化学方法测小鼠肝、肠、肾中的琥珀酸脱氢酶(SDH)、镁激活三磷酸腺苷酶(Mg2+-ATPase)、6-磷酸酶(G-6-Pase)、5’核苷酸酶(5’-Nase)和血清单胺氧化酶(MAO)的酶活性变化,结果显示只有MAO的酶活性减弱,其余四种的酶活性都增强,这揭示泰和乌骨鸡及其黑色素具有促进机体代谢、维持内环境稳定,延缓衰老的作用。胡泗才等研究了泰和乌骨鸡及其黑素对果蝇寿命及小鼠超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响,结果表明泰和乌骨鸡及其黑素对老龄小鼠肝细胞、红细胞中的SOD酶活性没有明显影响;还发现乌骨鸡及其黑色素有提高小鼠红细胞过氧化氢酶活性的趋势。另外,泰和乌骨鸡及其黑素可以提高果蝇的寿命,尤其是乌骨鸡黑色素能极为显著的延长雌性果蝇的平均寿命,这也表明乌骨鸡黑色素确实具有延缓衰老的作用。3.2乌骨鸡工况抗氧化作用研究发现,黑色素能够捕获自由基,具有抗氧化功能,可部分充当过氧化物歧化酶的作用,防止脂质过氧化。蔡华珍等研究发现,乌骨鸡黑色素能抑制2,2-二苯基-1-苦肼基(DPPH)自由基,且抑制率随黑色素浓度增加而提高;另外还发现黑色素能延缓油脂酸败,在70℃时黑色素浓度为0.1mg/mL的油脂,60h时酸价为0.3028mgKOH/g,而不加黑色素的对照样的酸价在第32h即升到0.3130mgKOH/g。涂永刚等相关研究结果进一步证实乌骨鸡黑色素具有显著的抗氧化作用,研究表明:乌骨鸡黑色素能清除DPPH自由基、超氧阴离子自由基,抑制脂质过氧化,具有较强的体外抗氧化作用,并且与合成黑色素比较,作用强于合成黑色素。李欣等采取双酶解法与碱液法相结合的方法提取乌鸡黑色素并研究其抗氧化活性,研究表明:乌骨鸡黑色素组小鼠血和肝脏中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力显著升高,丙二醛(MDA)水平显著降低,进一步证明乌骨鸡黑色素具有较强的体内抗氧化作用。3.3氧四硝基喹啉袁缨等发现乌骨鸡黑色素具有抗诱变作用,其对1,4-二硝基-2-甲基吡咯和一氧四硝基喹啉引起的大肠杆菌突变频率有明显的抑制作用,且抑制作用可随浓度增高而增强。郑从义等研究表明,黑色素可以抑制A和B型流感病毒诱导宿主细胞凋亡,还发现黑色素抗流感病毒诱导细胞凋亡机理与其阻断病毒吸附侵入宿主细胞有关。3.4对抗菌性质的影响蔡华珍等对乌鸡黑色素抗紫外功能进行了研究,结果表明:当乌鸡黑色素水悬液浓度高于0.009mg/mL时,黑色素对紫外线照射的唾液链球菌嗜热亚种和德氏乳杆菌保加利亚亚种、食品中的维生素C有明显的保护作用,浓度越高保护作用越强;黑色素的保护作用随着照射时间的延长而减弱,但与对照相比差异仍极显著;黑色素经光照、室温或低温处理后,其抗紫外线性质几乎未受影响;高温处理则影响较大,温度越高影响越严重,但与对照相比仍具有较强的抗紫外线功能。3.5保健体中微量元素的含量袁缨等应用原子吸收分光光度计和极谱仪测定乌骨鸡黑色素中Cu、Fe、Mn、Zn、Co、Mo、Ni等7种人体必需的微量元素含量,结果发现黑素中7种微量元素的含量高于乌鸡体内任何部位,这表明黑色素对微量元素有富集作用。涂勇刚等通过ICP-AES分析发现泰和乌骨鸡黑色素中含有多达17种金属元素,其中富含Ca、Fe、Mg和Zn等金属元素,这也表明黑色素对金属离子有富集作用。4乌骨鸡黑色素的合成轨迹和体内积聚分布规律4.1采后处理的真具体机制即是促进传统生物酶法合成真黑素的前体,并将其作为黑色素的生物合成过程十分复杂,到目前为止还在讨论之中。早年,一些学者认为酪氨酸酶(Tyrosinase,TYR)是黑色素合成过程中所需的唯一酶。20世纪90年代中期的观点认为多巴色素互变酶(DT)和5,6-二羟基吲哚羧酸氧化酶也参与了黑色素的合成,三种酶在黑色素生物合成过程中都起重要作用,此观点即所谓“三酶理论”。至此,黑色素的生物合成过程逐渐明朗。家禽中真黑色素的合成目前多遵循经典的Mason-Raper途径。黑色素生物合成是生物黑色素细胞(MC)分泌的酪氨酸酶催化体内酪氨酸(Tyr)羟化而启动的一系列复杂的生化反应的过程。在动物体内酪氨酸首先在酪氨酸酶的催化作用下生成3,4-二羟基苯丙氨酸(Dopa,多巴),多巴进一步在酪氨酸酶的催化下氧化成多巴醌(DQ),多巴醌经过多聚反应即与无机离子、还原剂、硫酸、氨基化合物、生物大分子的一系列反应过程生成无色多巴色素。无色多巴色素极不稳定,很容易被另一分子的多巴醌迅速的氧化成多巴色素(DC)。在多巴色素异构酶的作用下,多巴色素可羟化生成5,6-二羟基吲哚羧酸(DHICA),也可以脱羧生成5,6-二羟基吲哚(DHI)。5,6-二羟基吲哚在酪氨酸酶催化被氧化成5,6-吲哚醌(IQ),5,6-吲哚醌是真黑色素的前体,但是其它中间产物也可以自身或与醌醇结合产生真黑素。其中,酪氨酸酶是黑色素色生成的限速酶,其表达和活性决定黑色素合成的速度和产量。有关研究表明,黑色素的生物合成过程可能是由多个基因位点编码产物共同参与调控的复杂级联过程,其中TYR基因家族和Pmel17基因家族参与调节黑色素的生成。4.2乌骨鸡嘴唇沉积分布乌骨鸡体内色素过度沉着的机理至今还不太明了,早期的研究认为这种表型是由伴性基因Id和常染色体基因Fm控制的。近年来,国内外学者对乌骨鸡黑色素在体内的发生过程和沉积分布进行了广泛的研究,发现乌骨鸡体内的色素沉着发生在不同的器官中,并且在骨膜、内脏、表皮、羽毛中都有不同程度的色素沉着。国内外学者对乌骨鸡黑色素的体内沉积分布进行了相关的研究,结果发现乌骨鸡黑色素在体内的沉积分布规律是:骨膜,腹腔膜、气管、爪等部位黑色素分布最多,舌头、鸡冠、皮肤和肌肉中分布次之,内脏中黑色素分布最少;另在在乌骨鸡体内黑色素分布呈不均匀状态,并且含量的多少与乌骨鸡的乌度有关。4.3营养调控技术对和乌骨鸡体内权的影响关于泰和乌骨鸡体内黑色素的含量,有关研究表明骨膜中黑色素含量高达2.057%,皮肤中约含0.596%,肌肉中约含0.230%,内脏中黑色素含量仅为0.157%。最近两年,也有学者研究通过采用不同饲料和营养调控手段来提高泰和乌骨鸡体内黑色素的含量,研究表明利用营养调控技术是可以提高泰和乌骨鸡体内黑色素含量的。黎观红等通过调节日粮苯丙氨酸供给水平来研究其对不同周龄泰和乌骨鸡生产性能及组织中黑色素含量的影响,结果表明,通过调节日粮苯丙氨酸供给水平,可改善泰和乌骨鸡体内黑色素的沉积而不影响其生产性能。潘珂等研究了中草药添加剂对泰和乌骨鸡体内黑色素含量的影响,结果发现3种中草药添加剂复方均不同程度地提高了泰和乌骨鸡组织中的黑色素含量。赵艳平等研究了日粮酪氨酸水平对9-12周龄泰和乌骨鸡生产性能及组织黑色素含量的影响,研究发现以日粮中1.05%的酪氨酸为适宜水平时,泰和乌骨鸡组织中黑色素的合成量最大,生产性能最高。通过对乌骨鸡黑色素的体内沉积分布规律和含量分析的研究,可较为准确地判断黑色素在乌鸡体内的沉积分布,这就为乌骨鸡黑色素的提取分离纯化提供了有效地途径,也便于充分利用原料、降低黑色素的提取成本。5关于激素的提取分离乌骨鸡黑色素经常和蛋白质交联在一起,结合紧密、不易分开,因此乌骨鸡黑色素提取分离的关键是脱除蛋白质。要将黑色素单独分离出来,就需要采取科学有效的提取分离方法。目前常用的提取方法主要有盐酸提取法和酶解提取法两种,最近也有学者采用双酶解法与碱液法相结合或酶解法与回流相结合的方法来提取分离乌骨鸡黑色素。5.1盐酸提取法在国内,乌鸡黑色素的提取最早采用的是盐酸提取法。刘望夷等是国内最早采用盐酸法来提取乌骨鸡黑色素的学者。游艳华等对乌鸡黑色素的盐酸提取法进行了研究,对于试验方法中盐酸的用量、浸泡时间、回流时间等分离步骤进行详细而较成熟的研究。刘永忠等采用改良盐酸提取法对乌骨鸡鸡皮和鸡肉中黑色素的提取方法进行优化,探索并制定出了详细、可靠的提取方案。目前,盐酸提取法在乌骨鸡黑色素提取的试验研究中仍有广泛的应用,其操作基本步骤如下:全净膛乌鸡→取所需组织→绞碎→浓HCl浸泡→回流抽滤→洗涤纯化→沉淀物干燥→黑色素5.2从酶法和盐酸法分离乌骨鸡激素酸法提取黑色素简单、易操作,重复性好,但此法对黑色素的形态结构和活性影响较大,而且回流消耗时间长,耗能大。对此,90年代后期,国内一些学者开始研究采用较温和的酶解法来分离提取黑色素,并探索酶法分离提取乌骨鸡黑色素的最佳工艺条件。蔡华珍等采用酶法水解蛋白质分离乌鸡黑色素,并与盐酸法进行比较,发现酶法提取黑色素的得率高于盐酸法。李欣等研究采用双酶水解结合碱液除蛋白的方法提取分离了乌骨鸡黑色素,并确定了碱液除蛋白的最佳工艺条件:碱液pH10.0,温度60℃,时间1.5h,料液比1∶10,提取4次,得率为28.1%。酶法提取分离黑色素的基本步骤如下:全净膛乌鸡→剔骨取肉→绞碎→加酶、调pH、恒温水解→酶水解液→离心→过滤,收取沉淀物→清洗→黑色素以上两种提取乌骨鸡黑色素的方法各有其优点,但同时存在测定步骤繁多、不够灵敏快捷、对黑色素的结构有一定损伤、提取率需进一步提高等尚待改善的问题。因此今后可以在优化盐酸提取法与酶解提取法的提取工艺方面,或者在探索其他更为实用便捷、灵敏稳定的黑色素提取方法方面,进行更深更广的探索和研究。5.3乌骨鸡激素含量