顶空固相微萃取-气-质联用技术检测蟹类风味成分

顶空固相微萃取-气-质联用技术检测蟹类风味成分

分段青蟹也被称为“小黄螃蟹”，属于梭子蟹科。因为它的巨大个体、快速生长、鲜美的口感和丰富的营养，它一直被认为是一个宝贵的新鲜商品。青蟹在我国主要分布在广东、广西、福建、台湾、浙江等沿海省,也是一类可用于人工养殖的重要海洋经济物种。目前,对于蟹类等名贵水产品,国内外许多专家对其营养成分研究较多,但对其风味构成研究较少。风味是蟹等水产品的主要食用品质之一,而香气成分被认为是评价蟹风味质量的重要因素之一,在消费者的感官体验中占有不可替代的地位。自20世纪90年代以来,国外学者对蓝蟹、雪蟹等海水蟹类的挥发性风味成分做了一定的研究报道,鉴定得到了一些香气物质,但研究时主要采取的是同时蒸馏萃取法(simultaneousdistillation-extraction,SDE)。SDE法由于提取温度较高、提取时间长、提取过程中容易造成某些易挥发性风味成分的流失从而造成螃蟹整体风味成分的变化。近年来,针对于有复杂介质或含协同效应挥发性成分的样品而建立起来的气味指纹技术也已运用于水产品风味方面的检测,其中电子鼻(electronicnose)作为一种集分析、识别、检测复杂挥发性成分功能于一体的新型仪器,具有客观、准确、重复性好及无损等优点,而顶空固相微萃取-气-质联用法(HS-SPME-GC-MS)则能够对挥发物进行精确定性、定量,故而越来越受到人们的重视。笔者采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术和电子鼻技术对雌、雄锯缘青蟹的四个部位的挥发性风味成分进行了检测,比较了其不同部位间的差异性,确定了表征四部位的特征性气味物质,期望可以为以后深入研究其特征性气味的形成机理提供理论依据。1材料和方法1.1雄蟹病、丙酮、异丙醇、正丙醇锯缘青蟹活蟹6只(雌、雄各三只)购自上海市芦潮港水产品市场,置于低层铺冰的泡沫箱内迅速带回实验室;青蟹规格雄蟹体重(620.91±22.70)g,头胸甲长(13.93±0.13)cm,宽(10.13±0.12)cm;雄蟹体重(376.97±10.36)g,头胸甲长(12.42±0.17)cm,宽(9.36±0.12)cm;丙酮、异丙醇、正丙醇均为色谱纯,上海星可生化有限公司;C5~C20正构烷烃标准品西格玛奥德里奇公司;超纯水、NaCl(分析纯)国药集团化学试剂有限公司。Fox4000SensoryArrayFingerprintAnalyzer法国AlphaMOS公司;6890-5975B气质联用仪美国Agilent质谱公司;DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器巩义市予华仪器有限责任公司;手动进样手柄、萃取头[碳分子筛(CAR)/二甲基硅氧烷(PDMS)](涂层厚度75μm)美国Supelco公司。1.2gc-ms法锯缘青蟹活蟹洗净、捆扎后,放入不锈钢蒸锅内蒸制20min,分别采集其体肉、钳肉、足肉、性腺,用经消毒程序处理(刀口经火焰灼烧10s后再紫外辐照30min)的绞肉机绞碎。GC-MS实验:称取每份重为(5.00±0.01)g的绞碎后肉样,装入15mL棕色顶空瓶中。电子鼻实验:准确称取重(0.50±0.01)g、(1.00±0.01)g、(1.50±0.01)g、(2.00±0.01)g各3份肉样,立即装入10mL电子鼻自动进样瓶中,剩余肉样制成重为(2.00±0.01)g的小份装瓶。1.3新鲜肉样的进样和加样量进样体积优化:取18个新鲜待测肉样,按注射针进样体积不同分为六组(每组3个平行),依次编号为:250、500、1000、1500、2000、2500μL。各组于50℃平衡10min后,以洁净干燥空气为载气,流速150ml/min,按每组编号进样体积进样,1s进样完毕,注射针温度60℃,数据采集时间120s,延滞时间10min。确定最优进样体积为2500μL。加样量优化:取之前准备好的(0.50±0.01)g、(1.00±0.01)g、(1.50g±0.01)g、(2.00g±0.01)g各3份新鲜肉样,编为“0.5g”、“1.0g”、“1.5g”和“2.0g”三组。按2500μL的进样体积进样(其余参数不变)。确定最优加样量为2.0g。1.4gc-ms检测1.4.1顶空瓶溶液制备将内装样品的顶空瓶置于室温下平衡10min后,以SPME针管插入顶空瓶的硅橡胶瓶垫,伸出75μmCAR/PDMS萃取头,在沸水浴下吸附50min。待吸附完毕,取出插入GC-MS进样口,240℃解析5min,热脱附进行GC-MS检测。1.4.2电子击穿ei色谱柱:DB-5MS弹性毛细管柱(60m×0.32mm×0.25μm);不分流模式,起始柱温40℃,无保留,然后以5℃/min升至100℃,无保留;再以3℃/min升至180℃,无保留;接着以8℃/min升至240℃,保留5min;载气为He,流量1.0mL/min;汽化室温度240℃。质谱条件:电子轰击(EI)离子源;电子能量70eV,灯丝发射电流为200μA,离子源温度为200℃,检测器电压350V。1.5保留指数法rt-pca法GC-MS定性:挥发性成分通过NIST和Wiley谱库确认定性,仅报道正、反匹配度大于800(最大值为1000)的鉴定结果。保留指数(RI)计算公式:式中,Rt(x)、Rt(n)、Rt(n+1)分别为待测挥发物、含N及N+1个碳原子的正构烷烃的保留时间。挥发物的PCA分析由R2.7.2软件完成。电子鼻数据分析由仪器自带的AlphaSoftV11.0软件处理。2结果与讨论2.1电子鼻的结果2.1.1青蟹猪肉中加样量的确定由图1可知,进样体积、加样量的不同均会造成电子鼻传感器响应信号的差异,但此现象的成因不尽相同:进样体积不同会造成被测样品气味强度的差异;在一定程度上增加肉样质量(样品瓶中顶空体积应始终超过1/2),能使样品挥发出的气味物质的量增多。由图1(a)可知,随着加入肉样质量的增加,传感器响应值也会相应变大(但并不显著),为了尽量减少实验误差,同时参考他人经验,本实验中采用(2.00±0.01)g的加样量为宜。由图1(b)可知,18根传感器对500~2500μL进样体积的青蟹蟹肉气味均能作出不同程度的响应,且进样体积较加样量相比,对传感器响应值的影响力较大。18根传感器中,P10/1、P10/2、P40/1、P30/1、T40/1、TA/2这6个传感器响应值较高,区分效果良好。传感器响应值一般应大于0.4,但同时也不宜过高,以免样品因气味强度过大而造成传感器中毒而损坏仪器,本实验选择的最优进样量为2500μL(此时最大响应值为0.54)。2.1.2青蟹蟹类电子鼻各部位分布由图2可知,第一主成分与第二主成分贡献度之和均在93%以上。表明不同性别、不同部位的青蟹蟹肉、性腺气味差异明显,而此差异能在PC1、PC2构建的平面上充分展示。图2显示电子鼻区分指数为82,区分指数(discriminationindex,DI)最大值为100,其值越大表明不同组数据之间区分度越好,一般≥80表示能够有效区分。本图中DI值为82,表明不同性别、不同部位的青蟹蟹肉、性腺电子鼻数据组之间无重叠,区分度较好。进一步分析图2可知,雌、雄青蟹不同部位的电子鼻数据点均能较好区分开,且其分布存在一定规律性:性腺的气味较为特殊,无论是雌蟹还是雄蟹,其性腺数据点与3种蟹肉数据点距离较远,差异性较大。相对而言,体肉、钳肉数据点相对集中(基本处于第三象限),表明其整体气味较为相似。足肉数据点较体肉、钳肉相比有一定距离,雌青蟹足肉尤为明显,表明雌青蟹足肉气味较为特殊。2.2gc-ms的结果2.2.1蟹和雄蟹的挥发性风味物质从雌雄青蟹中分别检测出69种和71种挥发性风味成分。其中丙醛、2,4-己二烯醛、2,4-壬二烯醛、2,4-癸二烯醛、2-十一烯醛、1-甲基-1H-吡咯、3-甲基噻吩、二甲基二硫为雄青蟹独有的风味物。而1-戊烯-3-酮、2-辛酮、1-癸烯-3-酮、异丁烯醛、2-甲基-2-丁烯醛、2-乙基吡啶为雌青蟹独有的风味物。从表1中可见,雌蟹的足肉和雄蟹的性腺是挥发性风味物质含量较高的两个部位,并且无论是雌蟹还是雄蟹,体肉、钳肉、足肉、性腺四部位中峰面积居前两位的化合物都是1-甲基萘和苯甲醛。Yu、蒋根栋等人也对锯缘青蟹挥发物进行过报导,将本实验结果与其对照后发现,3-甲基丁醛、戊醛、己醛、庚醛、苯甲醛、壬醛、癸醛、正辛醇此8种化合物为三人共同检出物质,推测其可能是青蟹典型的挥发性风味物。2.2.2青蟹中的醛类化合物烃类化合物来源比较复杂,可能来自于脂质热降解产物或由烷基自由基的脂质氧化和类胡萝卜素的分解过程生成。该物质通常具有较高的阈值,对蟹类等水产品的总体风味贡献不大,但一些含苯环的芳香烃往往阈值较低,可对样本总体风味造成一定的影响。如实验中检测到的1-甲基萘和萘含量较高,且具有刺激性气味,可能来自外界环境。醇类可能由脂肪酸的二级氢过氧化物的分解、脂质氧化酶对脂肪酸的作用生成或由羰基化合物还原生成。一般来说,醇类具有香甜味、花香味、酸败或者土腥味,由于它们阈值较高,对蟹类香气的贡献很小。但是有些含量特别高或是不饱和的烯醇式结构阈值较低,可能会对风味有较大贡献。如1-辛烯-3-醇是亚油酸酯或亚麻酸酯的氢过氧化合物的降解产物,具有蘑菇、泥土的气味,它被鉴定为一种存在于甲壳类的主要挥发性醇。从表1可以看到,青蟹各部位中该醇的含量相对较高,可能与养殖水域环境有关。醛类一般是脂质的热降解产物,而烯醛和二烯醛则来源于亚油酸酯和亚麻酸酯的氢过氧化物的降解,通常具有香气。多不饱和脂肪酸的氧化产生各种醛(如辛醛和壬二烯醛),饱和的直链醛常有令人不快的气味并带有油的和蜡的特征气味,正如结果中所示,青蟹性腺中这两种物质的含量较高,可能是导致该部位腥味较重的原因之一。苯甲醛是由氨基酸的斯特克雷尔氨基酸反应生成的,有令人愉快的香气,是存在于蟹肉中的一种重要风味挥发物,从结果中也可以看到,各部位的苯甲醛含量均较高。而3-甲基丁醛、戊醛、己醛、庚醛、辛醛、壬醛和癸醛等作为低阈值醛类,虽然含量不高,但此类醛类即便在痕量条件下,也有一种很强的与许多其他风味物质重叠的风味效应,对构成蟹肉香味具有重要贡献。酮类化合物可能为多不饱和脂肪酸受热氧化和降解的产物、氨基酸分解或微生物氧化产生。对于蟹类等甲壳类水产品,C3~C17的甲基酮是碳链烃β-氧化及脱羧基作用后生成的,具有独特的清香和果香,且随着碳链的延长花香味也逐渐增加。二酮类是美拉德反应最初阶段的产物,提供了肉香和黄油香的理想平衡,但本次实验中并未发现此类化合物,张娜等同样采用固相微萃取的方法对中华绒螯蟹挥发性成分进行了研究,但是也没有发现该类化合物。其原因可能是该物质在蟹肉中的含量较低,虽然阈值较低,对蟹肉整体风味有所贡献,但仍不能被萃取头有效地吸附。烯酮类是肉制品在加热期间生成的一类脂质氧化的产物,有一种青叶的芳香气味。在蟹肉中也有烯酮类物质被报导,如1-辛烯-3-酮作为脂质氧化的产物,具有很浓的似玫瑰叶香,但在此次实验中并未检测到该化合物。而在雌蟹黄中检测到较高含量1-癸烯-3-酮,可能为青蟹香气成分的重要化合物,与蒋根栋等报道一致。杂环类化合物是美拉德反应的产物,在食品中通常对蒸煮和烧烤等风味有贡献。呋喃类化合物是脂质或硫胺素热降解的产物,通常具有较高的阈值,如检测到的2-乙基呋喃和2-戊基呋喃是亚油酸的氧化产物,具有可可豆风味,Hesieh等人发现该物质对于小龙虾和蟹肉的风味有负面的影响。吡嗪类化合物是美拉德反应和热解反应,通过斯特雷克尔氨基酸反应生成,对坚果味、土腥味和水果味有贡献,风味阈值较低。噻唑类化合物的形成途径很多,例如测得的2-乙酰基噻唑可能是半胱胺和2-丙酮醛反应生成,具有坚果和爆米花般的香气,大量存在于蟹和海鲜产品中。吲哚类化合物具有极强的挥发性和浓烈的焦油气味,浓度低于0.2μg/mL时具有令人相当愉快的气味,推测其可能是构成蟹肉风味成分的物质之一。含硫化合物来自含硫氨基酸或不饱和脂肪酸,因其阈值较低,是肉制品中生产肉香的重要化合物。前人在对熟虾、蟹肉风味的研究中发现了很多直链或杂环硫化物,特别是此次检测到的二甲基二硫和报道的二甲基三硫被广泛发现存在于经加热过的虾、蟹、牡蛎等海产品中,它们通常影响食品的整体风味。二甲基二硫被认为具有类似洋葱或白菜的香气,一般认为此类化合物是由乙硫醇的氧化产物或蛋氨酸的细菌降解产物。另外结果还表明,三甲胺在其他类化合物中含量较高,据报道,该物质广泛存在于蟹与海蟹中,由于其阈值较低,且具有海腥味,是青蟹肉独特风味的重要组成部分。2.2.3体肉、钳肉的特性对不同性别青蟹不同部位测得的挥发物按各自类别编号后(见表1),取其峰面积,采用R软件进行主成分分析(参考DiegoL),结果见图3(a)和图3(b)。图3(a)展示了雌雄青蟹四个不同部位所产挥发物总量的主成分分析结果,结果显示无论是雌性青蟹还是雄性青蟹,其性腺数据点均分布于第三象限,足肉数据点则基本上分布于第一象限,而体肉、钳肉数据点则基本集中于第四象限。将图3(a)与图2电子鼻结果比较后发现,两者蟹样数据点具有极高的相似性,唯一不同处为:电子鼻可将体肉、钳肉完全区分而GC-MS尚不能做到,表明电子鼻较GC-MS相比对挥发性风味物的灵敏度可能更高。图3(b)展示雌雄青蟹不同部位77种挥发物的主成分分析结果:每个箭头对应某一挥发物(不同