海洋放线菌的分离、筛选及色度学特性研究

海洋放线菌的分离、筛选及色度学特性研究

由于其环保、效率和无毒性等优点，海报纸逐渐成为研究的热点。例如，具有新结构的海洋抗生素和细菌素不仅具有良好的利用前景，而且对人类疾病（如肿瘤和细菌）等也具有良好的治疗前景。天然色素与人工合成色素相比具有无毒、安全性高、色泽自然鲜艳、营养价值高和药理功能等优越性,目前天然色素的来源主要依靠从植物中获取,因此受地域与环境的影响比较大。随着环保意识、健康意识的加强,人工合成的色素逐步不为人所接受,海洋微生物产色素丰富,且色素的生产不受空间环境等限制,具有很好的开发利用前景,如曾春民等从大亚湾分离到细菌Pseudomonas,能产生化合物灵菌红素(Prodigiosin),该色素可作为天然色素或抗菌素来开发;李雪萍从海洋羽毛山海绵Mycaleplumos中筛选到产十一烷基灵菌红素的海洋放线菌糖多孢菌Saccharopolysporasp.,并对其进行了提取及抗肿瘤性的研究;侯竹美等从胶州湾海域中筛选到一株产蓝色素的海洋链霉菌(Streptomycessp.),研究发现其对绿脓杆菌(Pseudomonasareuginosa)、隐球菌(Crytococcalmeningitis)有较强的抑菌活性。李厚金等从大亚湾中筛选到产红色素海洋细菌Pseudomonassp.;温露等从南海中筛选到海洋细菌Pseudomonassp.,该菌株产生蓝色素具有抗肿瘤的作用;谷志静等筛选到一株产类胡萝卜素的海洋光合细菌Rx。本文通过对产黑褐色色素菌株B2抑菌活性研究、分类地位确定及色素的基本性质研究,希望能为进一步开发有价值的海洋微生物天然色素提供参考。1材料和方法1.1材料表面1.1.1实验材料分别在浙江舟山的三江码头、鸭蛋山码头、东极岛、朱家尖、东港等地的潮间带采集海水、海泥。1.1.2acteriana高度细菌基因组DNA提取试剂盒(TIANampBacteriaDNAKit)由天根生化科技(北京)有限公司提供;常规化学试剂DNAMarker购自TaKaRa公司;其余均购于国药集团。1.1.3培养基培养基采用改良海水高氏1号固体培养基。1.2方法1.2.1分离培养专属种样品处理后用改良的高氏1号海水琼脂培养基进行分离培养,根据菌落的颜色、大小、形状等挑取单菌落进行划线分离得到纯种,并选取产色素的菌株进行筛选。1.2.2菌株和指示菌种采用滤纸片法对目标菌株进行筛选,以金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)1.128、大肠杆菌(Escherichiacoli)1.1100、白假丝酵母(Candidaalbicans)2.538、黑曲霉(Aspergillusniger)3.314、苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)1.788、副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)1.1616、胶质芽孢杆菌(Bacillusmucitaginosus)1.910作为指示菌,指示菌均购于中国普通微生物菌种保藏中心(CGMCC),测抑菌圈。1.2.3关于蘑菇的形态筛选到的菌株进行平板划线,并转接试管斜面进行保种,菌丝形态观察采用插片法。1.2.4不同添加剂的生长将筛选得到的目标菌株分别在几种常见培养基中进行培养,观察菌株的生长情况。1.2.5生理生化试验采用不同的糖作为碳源,对目标菌株的碳源利用情况进行观察。将筛选得到的目标菌株进行常规项目的生理生化实验,观察结果。1.2.6pcr扩增纯化及测序用细菌基因组DNA提取试剂盒提取目标菌株的DNA后进行PCR扩增,纯化后收集1500bp左右的PCR产物,交给宝生物工程(大连)有限公司进行测序。1.2.7系统发育树的建立利用Blast对得到的序列在数据库中进行相似序列的搜索,获得与目标菌株相似性较高的菌株(97%以上相似性),对同源性较好的序列进行比对,绘制系统进化树。1.2.8海水培养基粗制品的制备色素提取方法借鉴苏龙等对产红色素菌的提取方法,将菌株B2活化后接种于液体高氏1号海水培养基中,按50mL/250mL摇瓶量25℃进行培养,色素产生后取出,4500r/min离心10min收集上清液即为色素溶液,先用乙醇处理,后用四氯化碳进行萃取,褐色层用旋转蒸发仪蒸发浓缩,得到粗制品。1.2.9最大吸收波长的确定将浓缩色素液进行适当稀释后,以未接种菌株B2的液体培养基为空白对照,在340nm～620nm范围,用紫外可见分光光度计进行扫描,确定最大吸收波长。1.2.1自然光强度测试取5mL稀释色素液,调节pH分别为1、3、5、7、9、11,处理1～2h,在最大吸收波长处测试吸收值;将10mL稀释色素液置于培养皿中,以一定功率的自然光强度对其进行照射处理,分别照射1、3、5、7、10d,测其吸光值;取10mL稀释色素液分别在40、60、80、100、120℃处理3～4h,测吸光值。2结果与分析2.1基本情况介绍共分离到产色素的海洋放线菌菌株11株,具体情况如表1所示。产色素放线菌多来源于潮间带海泥中,颜色常见褐色与红色,在放线菌培养过程中菌落颜色常发生变化。2.2抑菌活性物质将产各种色素的菌株进行抑菌试验,抑菌试验结果如表2所示,有7种菌株产抑菌活性物质,其中菌株B2对大肠杆菌和副溶血弧菌具有较好的抑制作用。2.3关于蘑菇的形态的观察如图1所示,平板划线观察到菌株B2菌落灰白色,突起,呈现粉末状,易挑取,显微观察发现在菌丝末端有螺旋现象,且螺旋较为紧密。2.4葡糖糖天冬培养基上的生长菌株B2在不同培养基的生长情况如表3所示。在培养3d后,菌株B2在葡糖糖天冬培养基等三种培养基上未见生长,在其余几种培养基中有生长,但是长势较差。2.5淀粉酶菌株b菌株B2的生理生化试验结果如表4、表5所示,菌株B2可以产生淀粉酶,使明胶液化、还原硝酸盐。在碳源利用上,菌株B2不能利用鼠李糖,可利用葡糖糖、蔗糖、木糖等各种碳源。2.6核苷酸测序结果16SrDNA分子鉴定结果显示菌株B2的核苷酸长度为1376bp,将测序得到的核苷酸序列上传至NCBI的GenBank数据库获得登录号为:GU263839。2.7系统进化树的构建利用Blast软件,从GenBank数据库中查找同源性较高的菌株,利用其16SrDNA作为比对对象,来构建系统进化树,系统进化树如图2所示。系统进化树显示菌株B2与菌株Streptomycessp.28a-34-3同源性最好,相似性为99.8%,说明菌株B2是链霉菌属的一种。2.8光谱特性如图3所示,菌株B2在360nm～620nm出现了两个波峰,其中在波长为456nm时出现最大吸收值。2.9物理因素的影响2.9.1中性条件下吸光值的变化色素受酸碱性影响比较大,当pH小于5或者大于9的时候,吸光值明显降低,在中性条件下(pH=7)的时候比较稳定。pH对色素稳定性的影响见表6。2.9.2光的影响色素受光照影响较弱,在长时间光照下,色素性质仍旧保持稳定。2.9.3温度影响当温度超过80℃时,色素的稳定性较差,易于分解,不耐高温。3菌株的抗性和产淀粉酶能力在本次研究中,从舟山海域潮间带筛选到的产色素菌株B2,根据生理生化鉴定并结合16SrDNA分析结果显示,该菌株属于链霉菌属的一种,抑菌试验结果显示,该菌株对大肠杆菌及副溶血弧菌具有较好的抗性,同时发现该菌株具有产淀粉酶的能力,本次试验结果发现菌株B2具