发酵食品和发酵酒精饮料中生物胺的形成机制及控制措施

发酵食品和发酵酒精饮料中生物胺的形成机制及控制措施

1生物胺的组成及危害生物胺（ba）是由生物产生的一种低分子质量的有机化合物的总称。它们是生物体合成荷尔蒙、核苷酸、蛋白质的前体,因此生物体自身合成的适量生物胺具有促进生长、增强代谢活力、加强肠道免疫系统、控制血压和消除自由基等生理功能。但是过量外源生物胺的摄入会引起血管、动脉和微血管的扩大,导致生物体的不良反应,如高血压、头疼、腹部痉挛、腹泻和呕吐等。外源生物胺的摄入主要是通过食用或饮用微生物参与/混入加工的食品和酒类产品,如发酵肉制品、香肠、鱼露、奶酪等食品和发酵法生产的酒精类产品。根据结构可将生物胺分为:1)脂肪族,包括尸胺(cadaverine)、腐胺(putrescine)、精胺(spermine)和亚精胺(spermidine)等;2)芳香族,即酪胺(tyramine)和苯乙胺(phenylethylamine)等;3)杂环胺,包括组胺(histamine)和色胺(tryptamine)等。按组成成分的不同,又可将生物胺分为单胺和多胺这两类。前者主要包括组胺、酪胺、尸胺、腐胺、色胺、苯乙胺等,后者包括精胺和亚精胺。生物胺中毒性最大的是组胺,其水平偏高会导致头痛、高血压以及消化障碍。毒性次之的酪胺则易引起偏头痛和高血压等不适反应。生物胺中的尸胺和腐胺虽然毒性较小,但是能抑制组胺和酪胺代谢酶的活性,从而增加组胺和酪胺的毒性。此外,腐胺、尸胺、精胺和亚精胺可以与食物中的亚硝酸盐反应产生致癌物质亚硝基胺。生物胺引起人体中毒的水平因人而异,因此很难建立统一的衡量标准。但有研究发现,50%无食物不耐症病史的健康女性口服了75mg液体组胺后会产生不良症状。当食物中组胺含量在8~40mg时,会导致轻微中毒;40~100mg的组胺会引起中度中毒;超过100mg,严重中毒。人体内酪胺含量超过100mg时会引起偏头痛。在酒类产品中,生物胺的浓度较低,但是乙醇及酒中其他物质会加强生物胺的毒性,因此对酒类产品中生物胺的限量标准比普通食品严格。不同国家对酒中生物胺含量的限制不同,如德国:2mg/L;比利时:5~6mg/L;法国:8mg/L;瑞士:10mg/L。美国食品药物管理局(FDA)等机构对食品中生物胺含量的限制见表1。2在生物食物中制造生物胺生物胺广泛存在于各种发酵产品中(表2),现对各种产品中生物胺的产生情况进行阐述。2.1生物胺的生产水产品,如鱼制品最易导致生物胺中毒,这是因为:一方面,鱼制品含有丰富的高品质蛋白质、必需维生素和有益健康的多元不饱和脂肪酸,蛋白质分解后的产物肽类和氨基酸为生物胺的形成提供前体物质;另一方面,鱼肉营养丰富适于微生物的生长繁殖,再加上适宜的环境条件,很容易造成产品中生物胺过量积累。水产品中检测到的生物胺有组胺、酪胺、尸胺、腐胺、精胺和亚精胺等,其中组胺、尸胺和腐胺的含量是衡量产品安全与质量的主要标准。鲭亚目鱼,如金枪鱼、鰹鱼、秋刀鱼等含有大量的自由组氨酸,为组胺的生成提供丰富的前体物质,所以鲭亚目鱼中毒常与组胺联系起来。腐胺是鱼类产品腐败程度的主要指示剂,Kří�ek等在评价鲤鱼肉的质量时发现,腐胺的含量与鲤鱼肉腐败的程度呈很高的相关性。尸胺是鱼类产品腐烂初期检测到的主要生物胺,Ruiz-Capillas等发现在冰藏的鳕鱼中,尸胺含量显著增加,而组胺和酪胺没有明显变化。鱼类制品中生物胺的产生主要是由于运输、生产和分配中污染了具有氨基酸脱羧酶活性的微生物。Kim等研究了不同鱼制品中生物胺的形成与细菌的关系,发现在产品贮存过程中,产气肠杆菌可以生成大量的组胺、尸胺和腐胺,而肠杆菌属的其他种菌株主要生成尸胺和腐胺,产生的组胺较少。肉制品中以发酵肉制品中的生物胺含量为最高。因为肉制品生产原料含有丰富的蛋白类物质,降解后可得到大量氨基酸。再加上生产过程中的生产菌株和带入的外界微生物可能具有氨基酸脱羧酶活性,为生物胺的合成提供了机会。但是有研究证明,发酵肉制品中生物胺的积累主要是污染的微生物大量繁殖的结果,与生产中采用的发酵剂无关。2.2半硬成熟的发酵和生物胺的形成奶酪是乳制品中含有生物胺的主要产品。奶酪中检测出的生物胺主要有酪胺、组胺、尸胺、腐胺、色胺和β-苯乙胺等。乳制品中生物胺的积累,主要是由于牛奶在高温条件下发生蛋白水解产生大量氨基酸,以及制作过程中低pH值、低盐浓度等环境因素为微生物生产生物胺创造了有利条件。不同的乳制品中生物胺含量有差异,而且在同一种产品不同部位的生物胺的浓度也不同。成熟奶酪中生物胺的含量比非成熟奶酪高出10~2000倍。酪胺在半硬成熟奶酪的内部含量较高,在边缘较低,而色胺则相反,腐胺和尸胺的含量没有明显差异。在硬奶酪中,色胺的水平与半硬奶酪相似,而尸胺的积累却明显高于半硬奶酪。通常乳制品的生物胺中毒是由高水平的酪胺引起的,又称“CheeseReaction”。在蓝纹奶酪中,酪胺和组胺的含量可分别达到1585.4mg/kg和920mg/kg。奶酪成熟过程中,合成生物胺的氨基酸是由酪蛋白水解得到,并且氨基酸的含量随着奶酪成熟的时间逐渐增加。例如,在西班牙蓝纹奶酪(Cabrales)成熟的开始几天,氨基酸含量很低,几乎检测不到生物胺,15d后,随着氨基酸含量的升高,生物胺开始形成和积累。乳制品中的生物胺一般是由革兰氏阳性菌产生,其中组胺和酪胺的积累主要是具有氨基酸脱羧酶活性的乳酸菌导致的。这些乳酸菌来自产品的加工过程,有些甚至是生产中的发酵剂。Joosten等研究发现牛奶中污染极少量的布氏乳酸杆菌(Lactobacillusbuchneri)会导致制成的奶酪中生物胺的积累。有研究证明奶酪中大量存在的酪胺是由于牛奶中粪肠球菌(Enterococci)过量造成的。此外,一些从奶酪中分离得到的酵母菌,如汉逊德巴氏酵母(Debaryomyceshansenii)也具有产组胺的能力。2.3累的生物胺的种类酒精饮料与鱼制品和乳制品一样,都含有高水平的生物胺。酒类产品中,积累的生物胺主要是组胺、酪胺、腐胺和尸胺,其次是苯乙胺、亚精胺、精胺和色胺。生物胺的含量因酒的种类和产地不同而有差异,但都是在发酵的不同阶段由不同微生物(主要是乳酸菌)分泌的氨基酸脱羧酶作用于氨基酸的产物。2.3.1通过发酵产生的认识,会导致发酵异常啤酒中的生物胺与原料种类、麦汁糖化工序、酿造工艺及生产过程中受微生物污染的程度密切相关。啤酒中生物胺的来源有3类:1)原料,如麦芽中的腐胺、精胺和亚精胺等和酒花中的酪胺、β-苯乙胺等;2)麦汁糖化过程中产生的酪胺、尸胺等;3)发酵过程中产生的酪胺、色胺等。当发酵过程中污染了乳酸菌,将导致发酵异常,并伴随组胺的产生。由于啤酒中的组胺一般由乳酸菌(主要是乳酸杆菌)产生,其含量与原料种类、糖化工序和酿造工艺没有明显联系,因此,啤酒中组胺的含量可作为判定啤酒发酵是否受到外界微生物污染的依据。2.3.2微生物菌群和发酵用米黄酒发酵是糖化、酵母发酵与乳酸杆菌发酵同时进行的三边发酵。发酵酒醪中的乳酸杆菌主要是从外界环境的微生物菌群和发酵用米带入,而且在酒醪发酵过程中,65%的杂菌是乳酸杆菌。发酵过程中,曲霉分泌的蛋白酶和羧肽酶作用于蒸煮后原料米中的蛋白质产生的氨基酸或寡肽为生物胺的形成提供了丰富的前体,加上乳酸杆菌生长旺盛,将会造成生物胺的大量生成。2.3.3原料防范生物胺含量的影响葡萄酒是用新鲜的葡萄或葡萄汁经发酵酿成的酒精饮料。在葡萄酒中,有多种氨基酸能够被乳酸菌分泌的氨基酸脱羧酶脱羧,生成组胺、酪胺、腐胺、尸胺及苯乙胺等,但前3种是葡萄酒中最主要的生物胺。Marques等研究发现,葡萄产地、品种、发酵催化剂、酒(含沉淀物)的窖藏都会影响酒中生物胺的含量。葡萄本身就含有组胺和酪胺,还有一些挥发性胺和多胺。发酵过程中,原料葡萄不可避免带入或污染环境中的微生物,将周围的氨基酸脱羧形成生物胺。有研究表明,酒精发酵后葡萄酒中生物胺含量很低,因为在此过程中,乳酸菌刚开始生长繁殖,合成生物胺的活动较缓慢。而在苹果酸乳酸发酵后生物胺浓度呈现增长趋势,且红葡萄酒中生物胺含量比白葡萄酒高。此外,酵母自溶的过程中为乳酸菌合成生物胺提供氨基酸或肽类物质,也会导致酒中生物胺含量上升。2.3.4生物胺的积累目前对白酒中的生物胺还没有相关的研究,但是由于白酒的固态制曲和固态发酵是全开放的,空气、生产车间和设备上的微生物进入曲坯,参与了白酒固态发酵,微生物分泌的氨基酸脱羧酶作用于发酵过程中的氨基酸,必然会造成白酒中生物胺的积累。在污染的微生物中,乳酸菌所占比例最大。乳酸菌对白酒的口味和品质有很大的影响。乳酸菌利用酒曲中糖类发酵产生的乳酸,是形成白酒风味物质乳酸乙酯的前体。然而乳酸和乳酸乙酯含量过高会使得白酒口味酸涩,且酸性环境更有利于生物胺的生成,影响酒的品质。我国白酒产业的地位日益上升,但是对白酒的技术标准体系研究不够完善。生物胺作为广泛存在于白酒中的一种有害物质,严重影响白酒产业的发展。由于生物胺不易挥发且具有热稳定性,因此,在蒸馏工序中无法减少生物胺,导致成品酒中生物胺含量较高,应采取有效措施将其去除。3生物胺的来源除某些食品加工原料中带有少量生物胺外,食品生物制造过程中生物胺的形成主要有两种途径:1)由醛或酮的转氨作用生成属于脂肪族的生物胺,2)由氨基酸脱羧产生,即在微生物的氨基酸脱羧酶作用下,使游离氨基酸脱羧,生成相应的生物胺,并伴随二氧化碳的产生。食品生物制造过程中生物胺的形成以第二种途径为主。如图1所示,该途径需要3个条件:具有氨基酸脱羧酶活性的微生物、充足的生物胺前体物质(氨基酸)和用于氨基酸与生物胺在细胞内外输送的转运蛋白。游离的氨基酸在转运蛋白的作用下被从细胞外运送至细胞内,然后由氨基酸脱羧酶催化脱去羧基,生成相应的生物胺,生物胺再由转运蛋白输送到细胞外。在乳酸菌的基因组中,编码氨基酸脱羧酶和转运蛋白的基因通常是相邻的,有些还同调节基因以及编码蛋白质和氨酰-tRNA合成酶的基因一起组成基因簇。3.1发酵菌种seudomra食品中生物胺的主要制造者,是参与食品生物制造过程的微生物。这些能够产生生物胺的微生物,有些是食品原料中天然存在的,有些是来自食品加工过程中周围的环境。食品中常见的生物胺产生菌株见表3,它们主要是来源于肠杆菌属(Enterobacter)、肠球菌属(Enterococcus)、乳酸菌中的乳酸杆菌属(Lactobacillus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、链球菌属(Streptococcus)、酒球菌属(Oenococcus),以及梭菌属(Clostridium)和假单胞菌属(Pseudomonas)等的菌株。其中乳酸菌是食品中生物胺的主要制造者,比如用于发酵香肠和奶酪制作,以及葡萄酒、白酒和传统黄酒发酵法生产,乳酸菌都是主要生产菌株或参与生产的菌株。乳酸菌代谢产生生物胺是机体的应激机制在相对低酸和营养匮乏的条件下,乳酸菌为了维持自身生长,受胁迫机制调控而代谢产生碱性的生物胺。生物胺产生菌的鉴定主要有氨基酸脱羧酶培养基检测法和PCR法。培养基检测法是利用一种低酸和营养贫瘠的环境,诱导氨基酸脱羧酶,使微生物在大量的底物氨基酸存在的情况下,将氨基酸脱羧成为相应的生物胺。采用的氨基酸脱羧酶培养基中添加了溴甲酚紫作为显色剂,由于生物胺是碱性物质,再通过显色剂显色判定结果,从而检测有无氨基酸脱羧酶活性。PCR法是通过设计编码相应氨基酸脱羧酶基因的引物,检测微生物是否含有编码氨基酸脱羧酶的基因。3.2磷酸吡吾醛和丙氨酸酯类氨基酸脱羧酶(AADC)是催化脱去某种氨基酸的羧基,从而生成对应生物胺的裂解酶的总称。氨基酸脱羧酶的活力对生物胺的生成有很大影响,它的催化作用需要辅酶的参与。以组氨酸脱羧酶(HDC)为例,可以分为两类:1)来自真核细胞和革兰氏阳性菌,以磷酸吡哆醛为辅因子;2)来自革兰氏阴性菌,以共价的丙酮酰为辅基。HDC在低pH值环境下有活力,而中性时酶与底物的结合位点发生结构变化,导致HDC活性降低。目前发现的酪氨酸脱羧酶(TDC)均以磷酸吡哆醛为辅因子。真核生物的TDC可同时催化酪氨酸和多巴脱羧,而来源于原核生物如短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)的TDC只特异性地作用于酪氨酸。Marcobal等将屎肠球菌(Enterococcusfaecium)RM58的TDC基因在大肠杆菌(Escherichiacoli)中表达,编码的TDC除了作用于酪氨酸外,还可以将苯丙氨酸脱去羧基生成β-苯乙胺。赖氨酸脱羧酶(LDC)常见于革兰氏阴性菌中,它同鸟氨酸(ODC)、精氨酸脱羧酶(ADC)一样,活性可受低氧、高酸度和高氨基酸含量的诱导。3.3转导蛋白对生物胺的生物合成氨基酸作为生物胺的前体,是生物胺合成的重要限制因子。食品生物制造过程中,氨基酸主要来源于原料中的天然氨基酸或原料中蛋白类物质(如酪蛋白等)的降解。鱼制品、香肠等产品生产中所利用的原料如鱼类、肉类等富含动物蛋白,在生产菌株或污染的外源菌株分泌的蛋白酶或肽酶作用下降解得到丰富的氨基酸。可见,蛋白酶间接参与了生物胺的合成。因此,产品生产过程中添加蛋白酶会增加生物胺的积累。氨基酸在生物加工过程中的同化速率不同,也是造成相应生物胺积累的原因之一。如啤酒发酵过程中,酪氨酸、色氨酸和丙氨酸的同化速率较慢,脯氨酸同化速率极微,会造成酪胺和色胺等生物胺的积累。生物胺合成过程中的另一个重要参与者是位于细胞膜内的逆向转运蛋白,它的功能是将氨基酸运输到胞内,并将脱羧后的产物——生物胺分泌到胞外。Lucas等研究了组氨酸/组胺逆向转运蛋白(HdcP)后认为,由转运蛋白参与的摄取底物和分泌产物是一个偶联的过程,即氨基酸由胞外进入到胞内和相应的生物胺分泌到胞内是同时进行的。Wolken等研究了短乳杆菌中酪氨酸的脱羧途径,发现转运蛋白TyrP可同时促进酪氨酸-酪氨酸和酪氨酸-酪胺的交换。而来源于大肠杆菌的腐胺和尸胺转运蛋白(PotE和CadB),不仅可以分别促进鸟氨酸/腐胺和赖氨酸/尸胺的转运,还可以根据环境pH值的变化,调节腐胺和尸胺的运送方向。如在中性条件下,CadB可将胞外的尸胺转移到胞内,而酸性环境时,CadB则将尸胺分泌到胞外。4发酵剂中生物胺的提取随着食品安全要求越来越高,对生物胺的研究更加有意义。由于生物胺的过量积累产生很多不利影响,因此,去除产品中生物胺的研究显得尤为重要。生物胺是热稳定性物质,所以长时加热和烹调不能达到去除已有生物胺的目的。对于发酵食品如鱼露、发酵香肠等,传统去除生物胺的方法是通过冷冻、辐射、食品添加剂和防腐剂等来抑制微生物的生长,从而减少食品中生物胺的积累。有研究表明,向香肠中添加糖类物质,可有效减少尸胺。但是传统方法有一定的局限,对产品的风味质量会产生一定影响。4.1原料中氨基酸的用量对产品质量的影响从代谢角度出发,可通过减少底物来达到降低生物胺的积累,即控制产品生产过程中游离氨基酸的含量。但是氨基酸的来源主要是原料中蛋白类物质水解后的产物,减少氨基酸就应该先减少原料中蛋白质,这样可能会降低产品的质量。氨基酸是产品价值的一部分,其在我国的民族特色黄酒的保健功能中扮演重要的角色。在乳制品工业中,蛋白水解是奶酪成熟的必需步骤,水解得到的氨基酸是构成产品风味不可缺少的一部分。因此,减少氨基酸虽然可以在一定程度上控制生物胺含量,但是会对产品品质造成不利影响。4.2生物胺生物胺发酵菌种食品中生物胺的产生不仅是外界微生物的作用,还有生产菌株的参与。因此,用无氨基酸脱羧酶活性的菌株代替原生产菌株,可从源头减少生物胺的积累。这种方法适用于解决啤酒、葡萄酒中生物胺积累的问题,但是对于混菌体系(传统方法)或开放体系无法实现。4.3以生物胺和微生物菌种为主的发酵菌种由于乳酸菌产生的细菌素和苯乳酸对有些微生物的生长繁殖具有一定的抑制作用,所以在不影响产品质量的前提下可以将这类乳酸菌作为生产菌株应用到一些食品的生产加工中。Joosten等尝试了将产细菌素的粪肠球菌和产乳酸链球菌素Nisin的乳酸乳球菌作为生产菌株应用到奶酪的加工过程中,抑制了产生物胺菌株如布氏乳杆菌和短乳杆菌的生长,有效减少了生物胺的含量。因此,以乳酸菌为主要生产菌株的食品加工过程,则可以使用既无氨基酸脱羧酶活性,又能产生抑制剂的生产菌株,达到控制生物胺含量的目的。4.4生物胺的降解为减少生物胺的含量,除控制产生物胺微生物的生长繁殖外,还可以采用酶法降解已存在的生物胺,已经报道的降解生物胺的酶有胺氧化酶和氨脱氢酶。4.4.1生物胺的降解目前认为去除食品中生物胺最有前景的途径是通过生物学手段来减少生物胺的积累,即利用某些微生物产生的胺氧化酶将生成的生物胺降解,生成乙醛、氨和过氧化氢:已经报道的多种微生物含有降解生物胺的氧化酶,这些微生物至少可以降解一种生物胺,如沙克乳杆菌(Lactobacillussakei)可减少组胺的积累,干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)和植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)可去除酪胺,微球菌属的某些种可降解酪胺,亚麻短杆菌(Brevibacteriumlinens)可减少组胺与酪胺的含量,木糖葡萄糖球菌(Staphylococcusxylosus)也可以降解组胺与酪胺。因此,在国外研究的基础上,国内将可以合成胺氧化酶的优势菌株作为起始发酵剂应用于香肠、鱼露等发酵过程中,有效减少了产品中生物胺的含量。但是胺氧化酶降解生物胺的情况多出现在发酵食品中,对于酒类饮品,利用微生物产生的胺氧化酶来减少生物胺的途径并不可行。乙醇与生物胺会产生协同效应,直接或间接抑制胺氧化酶活性。有报道称,12%的乙醇会抑制91%的胺氧化酶活性,从而会加强生物胺的危害作用。此外,治疗某些疾病的药物也可以抑制胺氧化酶的活性,因此,对于服用胺氧化酶抑