01-博士研究生课-高级生物化学与分子生物学-专题-mRNA分子的选择性剪接-黄东阳

mRNA分子的选择性剪接黄东阳汕头大学医学院前言很多细菌和所有的真核细胞的RNA分子在合成后都需要某种程度的加工处理（processing)。RNA代谢中一些最令人感兴趣的分子变化就发生在这合成后的加工过程中。这包括一系列复杂的反应过程。其中剪接与选择性剪接的生物学意义越来越引起人们的广泛注意，观念不断更新，认识不断深入。原始转录本（primarytranscript)：一个新合成的RNA分子。真核生物的mRNA、tRNA分子和细菌的tRNA分子的原始转录本受到广泛的修饰。mRNA分子的原始转录本也称前体mRNA（precursormRNA)，一般包含一个基因的全序列，尽管编码多肽的序列可能是非连续的。内含子（Intron）：一个转录本的分隔编码区域的非编码序列。真核细胞基因的大部分都含有内含子，但有少数例外，如：组蛋白基因(histone)和酵母的一些基因。内含子长度一般在50-20,000核苷酸之间。外显子（exon):一个转录本的编码序列（片段）。真核生物的mRNA分子外显子的长度多在1000核苷酸以下，以100-200核苷酸居多。剪接（splicing)：将内含子从原始转录本移去并将外显子连接在一起,形成一个成熟的、功能性RNA分子的过程。5’cap：7-甲基鸟苷（7-methyl-guanosine）以少见的5’，5’-3磷酸的结合形式被连接在真核mRNA的5’末端。5’cap相邻的第一、第二个核苷酸核糖的2位羟基也常常甲级化。加帽发生在mRNA分子的前20-30碱基合成后。5’3’end：真核mRNA的3’noncodingendsequence（extraRNA)在切断信号（AUUAAA/AAUAAA）下游10-30个碱基处被切断，80-250个腺嘌呤核苷酸残基（A）被附加产生多聚A的尾端。剪接可发生在这一过程的前或后。也就是说mRNA原始转录本包括5’cap但可不包括3’PolyA尾。5′加帽的作用在于：①有助于保护mRNA免于被核糖核酸酶降解；④5′帽结合蛋白复合体参与mRNA和核糖体的结合来起始翻译过程。③促进mRNA从细胞核运输到细胞浆；②协助mRNA的剪接。在剪接第一个外显子时，剪接体的形成需要帽结合蛋白的参与；5’加帽、3’加尾以及剪接这三个步骤的加工似乎不是分别单独进行，各自精巧的蛋白质复合体有效地组织，相互连接并与磷酸化的RNA聚合酶II（PolII)C末端区域（Carboxyltermianldomain,CTD)连接，每个复合体影响其它复合体的功能。其它一些将mRNA转运至细胞浆的相关蛋白也与mRNA分子在核内相连，转录本的加工与转运偶联。实际上，一个真核细胞的mRNA分子刚一合成，就被包藏在由十几个蛋白质组成的精巧的复合体中。复合体的组成随着原始转录本的加工、转运到细胞浆乃至派送到核糖体去翻译，而不断发生着变化。RNA催化内含子剪接有两种内含子（groupIandgroupII)尽管剪接机制在细节上有别，但共享一特点——自我剪接（self-splicing)，没有蛋白质的参与。GroupI内含子存在于核、线粒体和叶绿体基因，编码rRNA、mRNA和tRNA。GroupII内含子多见于真菌、藻类和植物线粒体和叶绿体mRNA的原始转录本。偶尔也可在细菌中见到groupI和groupII内含子。两种剪接都不需要高能辅助因子如ATP等，但都有两步转酯（基）反应（transesterification）。一个核糖2’-或3’羟基对RNA骨架中的磷（phosphorus)发动亲核攻击（nucleophilicattack),原磷酸二酯键断开，形成新的磷酸二酯键。GroupI剪接反应需要一个鸟嘌呤核苷即核苷酸辅助因子（nucleotidecofactor)的3’羟基作为剪接第一步的亲核基团（nucleophile)，而不是作为能量。鸟苷3’羟基与内含子的5’末端形成磷酸二酯键。露出的外显子的3’羟基即可作为亲核基团去攻击内含子的3’末端。最后导致内含子被精确切除，外显子连接在一起。GroupII内含子的反应形式与GoupI相似，不同的是，第一步亲核攻击是由内含子当中的adenosine(A)残基中的2’羟基担当并形成一个分支的索套结构作为中间体。剪接体的剪接大部分剪接是依赖剪接体（spliceosome),这类内含子称为剪接体内含子（spliceosomal

introns)。剪接体：由一些特殊的RNA-蛋白质复合体——小核内核糖核蛋白（smallnuclearribonucleoproteins，snRNP,常发音为snurps)与一些其它蛋白质构成。每个snRNP含有一个100-200核苷酸长度的小核内RNA（smallnuclearRNAs,snRNAs)。真核细胞细胞核内比较常见的剪接体snRNA有5种，因富含U，故称U1,U2,U4,U5和U6。每种snRNA至少与7个蛋白质亚单位（共约50种蛋白）构成复合体snRNP

，这是一些从酵母到人类都高度保守的核酸和蛋白质序列。剪接体内含子在5’和3’末端一般分别含有双核苷酸序列GU和AG，以决定内含子的剪接位点。整个底物分子内含子中含有三个保守序列：（1）5’端起始序列（GUAAGU),称为5’端剪接点，也称剪接供体（splicedonor);（2）内含子3’端末尾序列：由(Py)nNPyAG组成，Py指嘧啶，n约为10（这一段嘧啶称为嘧啶束pyrimidinetract），N为任意碱基，3’端剪接点也称剪接受体（spliceacceptor);（3）在3’端序列的上游18-40个核苷酸处也有一个保守的A，称为分支点（branchpoint),酵母细胞是由UACUAAC组成，保守性极强，哺乳动物分支点序列（branchsequence)保守性较差。U1snRNA含有与核内mRNA内含子的5’剪接位点互补配对序列,U1snRNP与原始转录本的这一区域结合。U2snRNP配对、结合在分支点A附近（需ATP），产生一个膨出，有助于活化分支点A的2’-OH。U4、U5、U6附加（需ATP）形成非活性剪接体。在ATP作用下剪接体内部重排，U1和U4离脱，U6同时与5’剪接位点和U2配对，剪接体活化。完成剪接的第一步，内含子分支点中A的2’-OH与内含子5’剪接位点的G的5’-磷酸基团通过第一步转酯反应而结合，形成3’，5’-磷酸二酯键——构成套索（lariat)RNA结构。内含子上游外显子刚刚游离的3’-OH与下游外显子的第一个核苷酸的5’-磷酸基团进行第二步转酯反应，形成3’，5’-磷酸二酯键，两个外显子相连。mRNA的选择性剪接真核细胞基因表达所转录出的mRNA的剪接过程中，参加拼接的外显子可以不按其在基因组的线性分布次序拼接，内含子也可以不被切除而保留，即一个外显子或内含子是否出现在成熟的mRNA分子中是可以选择的，这种方式叫做选择性剪接（alternativesplicing)。选择性剪接可以使同一基因产生不同的蛋白质。选择性剪接违背了一个基因一个多肽的原则，使一个基因产生了诸多的蛋白质亚型。因此在产生复杂蛋白质组学方面具有重要作用。当一个转录本的多个位点存在多种不同的剪接方式时，一个基因可以产生数十种不同的蛋白质分子，果蝇的一个基因（Dscam,一种细胞表面蛋白)甚至可以产生38000种不同的蛋白质。40-60%（EST和cDNAdatasets)，也有报道高达73%(microarray+EST)的人类基因有选择性剪接。现已发现的常见选择性剪接方式有以下几种：（1）外显子选择（optionalexon):也称外显子跳跃（exonskipping),是指在不同的剪接方式中，某一个外显子（或几个外显子）可以在成熟的mRNA中保留，也可以通过剪接过程被去掉。（2）内含子选择（optionalintron):内含子可以被完全去掉，也可以有一个内含子被保留在成熟的mRNA中。（3）互斥外显子（mutuallyexclusiveexon):一对外显子中，在一种剪接方式中可在成熟的mRNA中保留一个外显子，而在另一种剪接方式中在成熟的mRNA中则只能保留另一个外显子。两个外显子不能同时出现在同一个成熟的mRNA中。（4）内部剪接位点（internalsplicesite):是通过对外显子或内含子内部5’剪接供点或3’剪接受点的选择，保留全部外显子或剪接掉某一外显子的部分序列；或去掉全部内含子或保留某一内含子的部分序列。初始转录本含有所有选择性加工途径所需要的分子信号。一种细胞偏好何种选择性加工途径取决于加工因子——RNA结合蛋白的特异性。负调节：抑制蛋白质可以通过与原始转录本的结合来防止剪接复合体切除内含子序列。选择性剪接可以被正负调节分子调节：正调节：而不能正常剪接的剪接复合体可以在活化蛋白的帮助下发挥剪接功能。SR蛋白质因构成RNA的核苷酸仅有4种，5’，3’剪接位点或分支点等关键序列以外，与之重复序列存在的可能性很大。因此，正确的识别还需要许多其它蛋白因子，包括一类蛋白质家族——SR蛋白的参与。SR蛋白结构特点是含有一个RNA识别、结合区域和多个蛋白质相互反应区域，C端富含不同长度serine-arginine的蛋白质，与剪接密切相关。当与外显子的剪接增强子序列结合时，SR蛋白通过跨越外显子的蛋白质相互作用网络，正确地介导U1snRNP向5’剪接位点，U2snRNP向分支点A结合。在外显子上组装的SR蛋白质，snRNP和其它剪接因子（U2AF等）的复合体称为跨越外显子识别复合体（cross-exonrecognitioncomplex)。据此，可以对长长的前体mRNA分子的外显子进行精确的特定。同一转录本在甲状腺产生降钙素，在脑则产生降钙素基因相关肽（calcitonin-gene-relatedpeptide,CGRP)人视黄醛还原酶mRNA的选择性剪接mRNAPre-mRNA同种异型mRNA剪接异常与疾病最新的资料显示，至少有15%，可能多达50%的人类遗传性疾病是由于共通剪接位点突变或更多的辅助元件，如外显子内含子剪接增强子（ESEs

和ISEs)和沉默子（ESSs和ISSs)的突变。以至于长期以来认为无害的蛋白质编码序列的同义变化现在看来可以导致严重的剪接结果而遭致疾病。大部分mRNA选择性剪接影响编码序列，其中一半导致阅读框架的改变，1/3导致产物遭到NMD清除。外显子不仅编码蛋白质不同部分的氨基酸，而且含有SR蛋白质结合的位点。发生突变时，即便不影响所编码氨基酸的变化，但干扰了SR蛋白的结合，会导致该外显子被跳跃。引起人类遗传性疾病的单一碱基对突变有15%干扰正常的外显子界定，主要有三种情况：1）一些突变发生在5’或3’剪接位点，经常导致附近正常序列的隐性位点（crypticsite）被利用。因为正常的剪接位点缺失时，外显子识别复合体识别这些替代位点；2）变异产生新的通用剪接位点代替了正常剪接位点；3；像SMN2那样，变异干扰剪接相关的蛋白与前体mRNA结合，从而增强或抑制剪接。脊髓性肌萎缩（spinalmuscleatrophy)是一种较常见的致儿童死亡的遗传性疾病。它是由一对相近的基因复制（geneduplication）产物，SMN1与SMN2所决定的。二者编码同样的蛋白质，但正常SMN2基因的表达很低，因为一个外显子发生沉默性突变，使得大部分产物发生外显子跳跃而失去功能。小鼠仅有一个SMN拷贝，纯合子对于生存是必须的。人类脊髓性肌萎缩是由于SMN1纯合子突变导致失活，少量的SMN2仅能够维持胚胎期而不足以维持儿童期发育而发病的。

无义变化介导的mRNA降解是真核细胞mRNA监视系统无义变化介导的mRNA降解(Nonsense-mediatedmRNAdecay,NMD）——当在同一阅读框架内的翻译终止密码子UAA、UAG或UGA提前出现在最后两个外显子交界处上游约50nt处时，mRNA被迅速降解。这些错位终止密码子被称为成熟前终止密码子（prematureterminationcodons,PTC），可以来自突变、重组、不完全或不正确剪接。无义变化介导的mRNA的降解TheEJCfunctionsasamolecularsignaltotriggerNMD,sincethepresenceofaPTCcausestheribosometoterminateprematurely,leavingdownstreamEJCmarksthatarenotremovedfromthemRNA,whichinturnrecruittheNMDmachineryandtriggermRNAdegradation.意义可以使某些异常的mRNA在被有效地翻译成蛋白质前得到清除，这个mRNA监视系统可以防止非正常截短的蛋白质的合成。NMD在进化过程中发挥了重要作用，使真核细胞更容易探究由于DNA重排、突变或不同剪接方式所形成的新基因免疫系统细胞的发育过程中也很重要，重排基因产生的这类mRNA被NMD系统迅速降解，避免了截短蛋白质的细胞毒作用。有足够的证据显示，选择性剪接与肿瘤的发生密切相关。影响肿瘤抑制基因选择性剪接的突变（BBCA1/2,WT1,APC，p73等），导致其非活性化是某些肿瘤易感性增加的原因；癌基因活化；选择性剪接在细胞凋亡方面也具重要作用，凋亡途径中的一些主要成分选择性剪接导致凋亡相反的作用。剪接因子SF2/ASF是一个原癌基因（proto-oncogene)，在许多肿瘤中表达升高；同样，其它一些与剪接相关的蛋白因子（SRp55等）也在一些肿瘤组织中高表达。invivosynthesisofretinoicacid

ROCyp1A1NRDRRAR/RXRclassicRAnuclearreceptorenzymesandproteinsinRAmetabolismPurificationandcharacterizationofanovelNADPH-dependentretinoldehydrogenase/reductase(NRDR)PurificationandcharacterizationofanovelNADPH-dependentretinoldehydrogenase/reductase(NRDR)NADPH-dependentretinoldehydrogenase/reductase

BelongstoSDRfamilyFirstlypurifiedfromthecytosoleofrabbitliverbyHuang,DYHighlycatalyticcapabilityofretinal

reductaseExpressedinmanytissuesofmammaliananimal,maybeparticipatesinageneralmetabolicpathwayofretinoids.

MolecularstructureofNRDRGeneofNRDRSegmentalDuplicationDHRS4基因的进化人视黄醛还原酶mRNA的选择性剪接mRNAPre-mRNA同种异型mRNAGSP:5'-p-TCCAGAGCATCCT-3‘A1:5`-CAGCCTTCAGTCCATCTCCT-3`S1:5`-GTTTCTCCATTTCTGGCACC-3`A2:5`-GAACATTAGGGTGAACTGCC-3NRDRcommonF:gcctccaccgacgggatcgg

NRDRcommonR:cttgtcccacacctcctc

NRDRiso

F:atggccagctccgggatga

NRDRiso

R:tcagaggcgggacggggttTwosplicingformsinnormaltissues,whereasmanyincarcinoma.clonedfromhumanliver,existsinvarioustissues.clonedfromHelacell.cervicalsquamouscarcinomatissues.selectivelyexpressedincervicalsquamouscarcinomatissues.clonedfromneuroblastomacells,existinvariouscarcinomacelllines,maybefunctionalncRNAregulatingDHRS4.SDSandWestern-blotanalysisofNRDRandNRDRB1expressionafterImmunoprecipitation.辅酶II依赖性视黄醇脱氢/还原酶选择性剪接亚型B1在Hela

细胞中的分布图中绿色荧光为GFP融合的辅酶II依赖性视黄醇脱氢/还原酶选择性剪接亚型B1(NRDRB1)，显示NRDRB1在Hela细胞内的分布。红色荧光显示Hela细胞中过氧化物酶体分布。该图说明NRDRB1部分定位到过氧化物酶体。(引自宋旭红,黄东阳等,InternationalJournalofCancer2007年120卷第8期封面文章)NRDR,AMulti-targetingProtein?Cytosole—Rabbitliver,HuangBBA1999Peroxisome—mouseliver,ZhangBiochemistry2003Mitochondria—Bioinformatics,N-ternimalsequencingMHKARVLLGGCTRTWKAVRNADPH-bindingsiteMechanismofRetinoid-inducedApoptosisinCancerCellsatypicalorsyntheticretinoids

Intranucl