实时定量r-pcr方法分析小鼠胸腺功能和状态

实时定量r-pcr方法分析小鼠胸腺功能和状态

胸腺是母乳喂养的中间免疫器官。这是t细胞的区分、发育、选择和成熟的重要场所。它的免疫功能在抗衰老、抗感染、肿瘤和自身免疫性疾病中发挥着重要作用。胸腺功能和状态的分析和研究一方面可以直接反映机体免疫状态;另一方面,HIV病毒感染、肿瘤化疗和造血干细胞移植等许多疾病导致的免疫缺陷都与胸腺功能障碍有关,因而有关胸腺功能与状态分析及其检测方法的研究成了近年研究的热点。胸腺的功能和状态主要由胸腺微环境执行和体现。本研究建立了实时定量RT-PCR的分析方法,对于小鼠胸腺微环境内的相关基因的表达进行准确的定性和定量,分析胸腺微环境及其中细胞的状态,直接有效地评价胸腺功能和状态。1材料和方法1.1材料表面1.1.1pcr扩增检测Trizol试剂盒(美国Invitrogen公司),Oligo(dT)15Primer(美国promega公司),M-MLVReverseTranscripIptase(美国promega公司),GeneTAQThermalStableDNAPolymerase(英国基因有限公司),SYBRPremixExTaqTM(日本Takara公司),100bpLadder(日本Takara公司),ABIPrism7300sequencedetector(美国ABI公司),LKBBiochorm4060紫外分光光度计(瑞典Pharmacia公司),96孔PCR板(forABI,美国Axygen公司)。1.1.2小鼠、大鼠、国家动物中心1周5只,体质量10g;36周5只,体质量30g,均为SPF级BALB/c小鼠,雌雄兼有,购自南方医科大学实验动物中心,合格证号:0002959。1.2方法1.2.1鼠胸径、细胞培养分别处死1周和36周小鼠,无菌取小鼠胸腺,200目筛网碾磨,收集细胞悬液,胸腺细胞1000r/min离心10min,洗涤2次,计数。1.2.2细胞rna的提取按照TRIzol试剂盒说明书抽提106～107细胞RNA,抽提的RNA用DEPC处理水溶解,0.8%琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度计检测抽提的RNA,-70℃长期保存。1.2.3但是，分段的rt-pcr扩增1pcr扩增片段的分析根据GenBankmRNA序列:BC023196.1、NM008505.3、NM008238.1、NM008371.2分别设计引物。GAPDH的上下引物分别为:5′-CAAAGTTGTCATGGATGACC-3′,5′-CCATGGAGAAGGCTGGGG-3′,扩增的片段大小为200bp;LMO2的上下引物分别为:5′-CTGAGGAACCCGTGGATGAG-3′,5′-CGACACCCACAGAGGTCACA-3′,扩增的片段大小为150bp;Foxn1的上下引物分别为:5′-GACCTTGGGACTGACCTGGAT-3′,5′-TGCCTGTTTCTGCCAGACAA-3′,扩增的片段大小为204bp;IL-7的上下引物分别为:5′-TCTGCTGCCTGTCACATCATC-3′,5′-GGACATTGAATTCTTCACTGATATTCA-3′,扩增的片段大小为250bp。引物由上海博亚公司合成,灭菌的去离子水稀释引物浓度为10μmol/L。2pcr反应条件的确定本研究采用两步法进行反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)。其中PCR的反应程序为95℃预变性3min1次,94℃变性35s,60℃退火1min,35个循环。鉴定产物后,摸索PCR反应最适当的扩增条件,包括最适合的模板浓度、引物浓度200～500nmol/L、dNTP浓度50～400μmol/L、镁离子浓度1.5～5mmol/L及退火温度55～65℃。从而减少非特异性条带和引物二聚体的产生,减少测量误差。1.2.4检测pcr扩增结果本实验实时定量PCR反应在ABIPrism7300sequencedetector中进行,使用实时定量PCR试剂盒(SYBRPremixExTaqTM)。根据试剂盒说明书以及上一步普通RT-PCR的优化结果,在96孔PCR反应板中配置反应体系。反应条件为95℃10s预变性一次,95℃30s,60℃15s,40个循环。在同一批反应中,设置样品Foxn1片段PCR组,样品LMO2片段PCR组,样品IL-7片段PCR组,样品GAPDH片段PCR组,阴性对照组,各组都设2个平行重复。实时定量PCR反应结束后,ABIPrism7300SDS1.3软件保存结果并分析。根据PCR获得的熔解曲线和扩增曲线分析结果的可靠性并设定阈值,输出Ct值。采用比较Ct值定量方法进行基因表达的比值计算。具体的公式为:2-ΔΔCt,其中ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct管家基因)实验组-(Ct目的基因-Ct管家基因)对照组。2结果2.1od20/400比值小鼠胸腺细胞RNA获得后,紫外分光光度计检测OD260/280比值在1.7～2.0内。电泳结果也证实RNA质量较好并没有基因组DNA和蛋白质的污染。2.2反应体系的确定cDNA中GAPDH、LMO2、Foxn1、IL-7基因表达分别扩增后,电泳检测可观察到特异性电泳条带,与预测的目的基因片段大小相同,并在进行第2次PCR后证实确为目标产物(图1)。确定的反应体系是25μL,上下游引物各200nmol/L,MgCl23.5mmol/L,dNTP250μmol/L,模板cDNA4μL。条件优化后结果显示,PCR条带特异性强,无明显非特异性条带。2.3基因组化法检测产物的敏感性和准确性实时定量RT-PCR扩增结果显示,获得的反映核酸扩增过程的扩增曲线为S形动力学曲线,不同基因的熔解曲线均为产物单一峰,证实了产物的特异性和准确性(图2)。确定实时定量RT-PCR反应体系是25μL,上下游引物各200nmol/L,模板cDNA2μL。2.43表达变化比值36周小鼠相对于1周小鼠的胸腺相关基因表达变化比值为:LMO22.54±0.08、Foxn10.68±0.02、IL-70.15±0.03。3实时定量rt-pcr检测细胞发育机体T淋巴细胞在胸腺内发育、分化、成熟、输出的过程以及各种胸腺激素的分泌等功能主要是由胸腺微环境执行和体现的。胸腺微环境是一个高度异质性的三维网络,由胸腺上皮细胞、胸腺细胞以及细胞外基质等共同构成。T细胞在胸腺内的发育是一个比较复杂的过程。在特定阶段表达的转录调控子可以调节T细胞发育的过程,其中:LMO2是一类负调节因子,调控T细胞的双阴性(DN)至双阳性(DP)发育过程调节蛋白E2A。LMO2在DN1和DN2期特定表达,而在正常的DN到DP发育过程中必须是非激活状态,否则影响细胞的发育。Foxn1(whnthenudegene)转录因子是胸腺上皮细胞(TEC)所表达的,并且为胸腺的器官发生过程中的TEC的增殖和分化所必须。Foxn1基因的缺失在人和小鼠中都导致了严重的胸腺缺失和免疫缺陷。IL-7(Interleukin-7)是分子量为25kU的糖蛋白。近年来的体内体外实验已经证明IL-7不仅是早期B细胞的生长因子,也是胸腺早期T细胞的维持生长因子。因此,作者选择以上几个胸腺微环境的相关基因的表达进行分析,从而有效地评价小鼠胸腺的功能和状态。另外,GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase)是逆转录PCR中常用的内参,它是一类管家基因(housekeepinggene),在真核细胞的基因组里多拷贝恒定表达。作为内参,它和目标基因同批扩增,用来校正样品之间由于RNA浓度的不同而产生的误差。本研究通过利用实时定量RT-PCR技术对于1周和36周小鼠的胸腺功能和状态进行了比较研究,结果发现,36周小鼠的Foxn1、IL-7基因的表达下降,而LMO2基因的表达量上升。胸腺的多种分泌因子(Foxn1、IL-7)表达活性下降表明,36周小鼠胸腺微环境中的胸腺上皮细胞活性和功能下降,胸腺微环境受到