1例肾上腺脑白质营养不良家庭成员ald基因突变的r-pcr鉴定

1例肾上腺脑白质营养不良家庭成员ald基因突变的r-pcr鉴定

肾上腺白质营养不良（ald）是一种遗传因素。其发病机制是：人体极长链脂肪酸（vlcfa）对亚硝酸盐酶（vlcfa）的氧化影响，过度储存，导致神经系统脱离髓鞘改变和肾上腺皮质功能减退。该病属X染色体连锁隐性遗传,男性患病率为1/25000～50000。根据起病时间和临床表现,可分成6种临床类型。血浆、红细胞和皮肤成纤维细胞中VLCFA(主要是C26∶0和C24∶0两者)异常升高是各临床类型的共同生化特征。引起ALD的致病基因被称为ALD基因,所编码的蛋白质称为ALD蛋白(ALDprotein,ALDP)。目前,国际上已在ALD患者中发现了300多种ALD基因突变。国内有关ALD的报道涉及数10例患者,但作者尚未见有关中国ALD患者ALD基因突变研究的文献报道。最近,我们分析了江西黎川地区的1例肾上腺脑白质营养不良患者及其家系成员的ALD基因,发现1个新的ALD基因突变。材料和方法一、病理组织学检测病例简介:患者男,15岁。以智力减退1年伴视物不清3月余为主诉入院。体检:发育正常,心、肺、腹未见异常,神志清楚,对答切题,计算力、记忆力、反应力下降,闭目行走困难,Romberg征轻度不稳,未引出病理征。脑电图检查示弥漫性高波幅慢波。颅脑MRI示:双侧侧脑室三角区周围及顶、枕区对称的大片状、局限于脑白质的蝶形脱髓鞘病变。在北京友谊医院查血清极长链饱和脂肪酸浓度:C26∶0为0.72μg/ml[正常参考范围:(0.509±0.169)μg/ml],C24∶0/C22∶0比值为2.2(正常参考范围:0.893±0.125),C26∶0/C22∶0比值为0.09(正常参考范围:0.025±0.0072)。临床诊断:肾上腺脑白质营养不良(青少年脑型)。患者父母健在,有两个姐姐、一个弟弟,均未查出有与患者类似的临床表现。二、方法1.引物和试剂RNA提取试剂盒(RNeasyMini试剂盒)和DNA提取试剂盒(QIAampDNABloodMini试剂盒)为Qiagen产品,cDNA合成试剂盒(ReverseTranscriptionSystem)为Promega产品,DNA片段凝胶回收试剂盒为Viogene产品,限制性内切酶Hin6I、Taq酶为MBI产品,引物委托上海Sangon生物工程技术服务有限公司合成,PE2400DNA扩增仪、测序反应试剂盒(Bigdye)、自动DNA序列分析仪(ABI377)为Perkin-Elmer产品。2.pcr索引根据国外参考文献合成4对引物,分片段(ALD1～4)扩增整个ALD基因cDNA编码区,引物序列见表1。3.合成cdna外周血总RNA的提取按Qiagen产品说明书进行,以RT-2引物(见表1)或Oligo(dT)15为引物合成cDNA,分别用于ALD1、ALD2和ALD3、ALD4片段的扩增。4.ald1me总反应体积25μl中含:cDNA模板1μl,引物各15pmol、4种dNTP各0.2mmol/L、Taq酶2U、MgCl21.5mmol/L。ALD1按下列条件扩增:94℃预变性4min后,94℃,60s;56℃,60s;72℃,60s;共30个循环。最后1个循环结束后继续在72℃延伸9min。ALD2、ALD3、ALD4退火温度分别为58℃、55℃、55℃,其他扩增条件同ALD1。扩增产物按常规在1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳,在紫外线下用手术刀片切下含预期区带的凝胶块,用DNA凝胶回收试剂盒从中回收。5.直接恢复段的序列回收的ALD1～4各片段以相应引物,委托上海生工生物技术有限公司采用末端终止法进行序列测定。6.扩增片段聚合酶5-gcctctacagac基因组DNA按试剂盒说明自外周血提取。根据Sarde等报道的ALD基因组序列,用OMIGA2.0软件设计针对外显子1部分序列的引物对,901F∶5′-GCCTCTACTTCTCCCAGCAGAC-C-3′;1E85R∶5′-ACTGTCCCCACCGCTCACG-3′,扩增片段长470bp。扩增条件:95℃预变性4min后,94℃,45s;60℃,30s;72℃,45s;共30个循环。在最后1个循环中,72℃延伸时间为10min。扩增产物纯化回收后,经限制性内切酶Hin6I消化后,上样于12%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳,电泳结束后溴乙啶染色15min,紫外灯下观察结果并拍照。结果一、ald基因的pcr检测:cALD基因cDNA的开放读框长2235bp,本研究将其分成4个相互重叠的片段进行PCR扩增,各片段的预期大小为(按ALD1至ALD4顺序):722、700、723、646bp。PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析证实各扩增片段大小与预期相符(结果未显示)。将各PCR产物纯化后,直接进行序列测定。从图1可以看出,与同时进行分析的1名正常对照相比,患者ALD基因第280密码子(位于外显子1)发生CGC→CTC改变(反义链为GCG→GAG),使原来的精氨酸被亮氨酸替换(见图1)。正常对照的ALD基因序列与文献报道和GenBank数据库的序列一致。二、内镜cctc基因突变用引物901F和1E85R扩增ALD基因的基因组DNA部分序列,片段长度为470bp,覆盖第280位密码子。该片段内含2个Hin6I酶切位点(G↓CGC),患者第280位密码子发生CGC→CTC突变后将导致其中1个酶切位点消失,酶切片段长度发生改变:患者应为303bp、167bp,正常人应为303bp、147bp、20bp,杂合子应为303bp、167bp、147bp、20bp。图2为酶切产物电泳结果,可以看出:正常对照、患者大姐、患者弟弟均有303bp、147bp片段(20bp片段不易见到),为正常基因型;患者有303bp、167bp片段,X染色体上存在错义突变,患者母亲和二姐有303bp、167bp、147bp片段,为杂合子(携带者)。三、患者住院档案见图3。ald基因s180l突变ALD基因定位于Xp28,全长约21kb,含10个外显子和9个内含子,其mRNA长3.7kb,所编码的ALD蛋白含745个氨基酸残基。ALD蛋白位于过氧化物酶体膜上,分成一个跨膜区(含6个跨膜片段)和1个ATP结合区,属于ATP结合盒(ATP-bindingcassette,ABC)转运蛋白超家族成员。国外对该病的基因诊断始于1994年,至今已发现300余种ALD基因突变,其中54%为错义突变,26%为移码突变,10%为氨基酸插入或缺失,约10%为无义突变,突变遍及10个外显子。位于外显子5的1801delAG突变是一个热点,发生率约为12%。ALD基因突变可导致ALD蛋白稳定性下降、功能缺陷或肽链大段缺损,最终影响VLCFA在过氧化物酶体内的β氧化。基因突变类型与各类临床表现之间相关性不明显,提示可能尚有其他未知的遗传或环境因素影响该病的临床表现。本研究是国内首次对中国肾上腺脑白质营养不良家系进行的基因诊断。我们采用RT-PCR技术,分4个片段扩增患者ALD基因cDNA全部编码序列。对PCR产物的直接序列测定表明患者ALD基因序列仅在第280位密码子处与正常人不同:患者的第280位密码子为CTC,编码亮氨酸;而正常人的为CGC,编码精氨酸。依据突变位点而设计的对基因组DNA片段的Hin6I酶切分析,进一步确证患者ALD基因存在R280L错义突变。查阅国内外文献及有关电子数据库,可见美国Steinberg等曾在同一密码子处发现R280C突变(因特网资料,未见正式发表),未见有关于ALD基因R280L突变报道。发生突变的氨基酸残基位于ALDP的跨膜区,在ABC转运蛋白家族中属于保守氨基酸。该突变如何影响A