氨基酸多肽和蛋白质类药品检验

第十章

氨基酸、多肽因子和蛋白质类药品检验1整理课件第九章

抗生素类药物分析与生物检定法根本要求：掌握氨基酸定性鉴别的方法，熟悉氨基酸特殊杂质及平安性检查，掌握氨基酸含量测定方法，掌握多肽因子类药物的定性鉴别方法，熟悉多肽因子类药物的检查方法，掌握多肽因子类药物生物效价的测定方法，掌握蛋白质类药物的鉴别和检查方法，掌握蛋白质含量测定和效价测定方法，了解几种氨基酸、多肽因子和蛋白质药物的质量分析过程。2整理课件第九章

抗生素类药物分析与生物检定法根本内容第一节氨基酸类药品检验第二节多肽因子类和蛋白质类药品检验第三节几种氨基酸、多肽因子和蛋白质药物的质量分析3整理课件第一节

氨基酸类药品检验氨基酸是治疗蛋白质代谢紊乱、蛋白质缺损所引起的一系列疾病的重要生化药物，也是具有高度营养价值的蛋白质补充剂，有着广泛的生化作用和临床疗效。目前氨基酸及其衍生物临床应用不断开展和扩大，创制了一些新的生化药物。如甲基酪氨酸治疗嗜铬细胞瘤氧苯丙氨酸用于类癌瘤综合征偶氮丝氨酸治疗白血病乙酰羟脯氨酸用于治疗类风湿关节炎4整理课件第一节

氨基酸类药品检验氨基酸为白色晶状体，熔点很高，多在熔融时分解，都能溶解在强酸强碱中，形成的盐多能溶于水。氨基酸在等电点〔pI〕时溶解度最小，最稳定。中性pI值在5～6.3左右。酸性pI值在2.8～3.2左右。碱性氨基酸的pI值在7.6～10.8左右。5整理课件第一节

氨基酸类药品检验一、氨基酸的定性鉴别旋光度、熔点、溶解度、纸层析、氨基酸自动化分析、气相色谱等均可作为氨基酸鉴别的依据。1、化学鉴别法氨基酸的鉴别最常用的方法是根据所有氨基酸均能与茚三酮显蓝紫色。采用茚三酮显色法，中国药典〔2021年〕二部对所收载的氨基酸类药物大多采用此方法进行鉴别。如要对某种氨基酸加以鉴别，可借助于一些特定的显色反响。6整理课件第一节

氨基酸类药品检验〔1〕茚三酮反响茚三酮在酸性溶液中与α-氨基酸共热，引起氨基酸氧化脱氢、脱羧反响，最后生成紫色物质。7整理课件第一节

氨基酸类药品检验〔2〕在室温下氨基酸与亚硝酸反响，生成氮气。在标准条件下测定生成氮气体积，即可计算氨基酸的量。注：生成的氮气只有一半来自氨基酸。8整理课件第一节

氨基酸类药品检验〔3〕9整理课件第一节

氨基酸类药品检验〔4〕10整理课件第一节

氨基酸类药品检验〔5〕11整理课件第一节

氨基酸类药品检验〔6〕12整理课件第一节

氨基酸类药品检验〔7〕13整理课件第一节

氨基酸类药品检验〔8〕乙醛蒸气接触亚硝基铁氰化钠和二乙胺时蓝紫色14整理课件第一节

氨基酸类药品检验〔9〕组氨酸的侧链咪唑基也能与重氮苯磺酸反响形成与Pauly反响相似的化合物，呈棕红色。15整理课件第一节

氨基酸类药品检验〔10〕借助这些特定的显色反响可以对氨基酸进行鉴别。16整理课件第一节

氨基酸类药品检验2、光谱鉴别法〔1〕紫外吸收光谱法在20种天然氨基酸中，只有酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸在紫外区有最大吸收。酪氨酸的max＝275nm275=1.4x103苯丙氨酸的max＝257nm257=2.0x102色氨酸的max＝280nm280=5.6x10317整理课件1：酪氨酸2：色氨酸3：苯丙氨酸。第一节

氨基酸类药品检验这三种氨基酸可以通过紫外吸收光谱加以鉴别。精密称取酪氨酸、色氨酸、苯丙氢酸各适量。用水制成每1mL含20μg〔色氨酸〕、40μg〔酪氨酸〕、200μg〔苯丙氨酸〕。在波长230～300nm测定各氨基酸的吸收光谱，如右图。18整理课件第一节

氨基酸类药品检验〔2〕红外吸收光谱图氨基酸在红外区都有特性图谱，可以通过与标准氨基酸图谱比较作为氨基酸的鉴别依据。用红外分光光度法进行氨基酸鉴别时，除另有规定外，通常固体供试品均采用溴化钾片法，在400～667cm-1范围内测定其吸收图谱。所得的吸收图谱各主要吸收峰波长和各吸收峰间的相互强度关系均应与对照的图谱一致。19整理课件第一节

氨基酸类药品检验3、薄层色谱鉴别法在薄层板上点样，通过与标准氨基酸对照而鉴别氨基酸。〔1〕薄层板的制备20整理课件第一节

氨基酸类药品检验〔2〕十一种氨基酸混合液〔色、蛋、亮、异亮、甘、赖、苏、缬、苯丙、组、精〕与对照液的制备。21整理课件第一节

氨基酸类药品检验〔3〕点样、展开和显色吸取混合液和对照液各3μL，分别点于同一薄层板上。以正丁醇-水-异丁酸-醋酸〔50︰50︰5︰7〕之上层作展开剂，进行单向三次展开，展开约15cm，每次必须待溶剂挥发尽后，再进行下一次展开。喷以显色剂〔吲哚醌1g，溶于100mL无水乙醇和10mL冰醋酸中〕置100℃枯燥5～10min至显色完全为止。22整理课件第一节

氨基酸类药品检验本层析系统中，由于别离的程度与各种氨基酸显出不同的颜色，可以区别十一种氨基酸。用茚三酮-硝酸钠试剂亦能显出不同颜色的色斑，且灵敏度较高。用E.Merck规格微晶纤维素比其他规格的微晶纤维素的别离效果和重现性较好。23整理课件第一节

氨基酸类药品检验〔3〕点样、展开和显色吸取混合液和对照液各3μL，分别点于同一薄层板上。以正丁醇-水-异丁酸-醋酸〔50︰50︰5︰7〕之上层作展开剂，进行单向三次展开，展开约15cm，每次必须待溶剂挥发尽后，再进行下一次展开。喷以显色剂〔吲哚醌1g，溶于100mL无水乙醇和10mL冰醋酸中〕置100℃枯燥5～10min至显色完全为止。24整理课件第一节

氨基酸类药品检验二、氨基酸特殊杂质及平安性检查1、特殊杂质检查氨基酸原料药所含有的特殊杂质一般为一些其他种类的氨基酸。用薄层色谱法进行限量检查：将样品配成一定浓度的供试品液，取一定量供试品液稀释后作为对照液，在同一硅胶G薄板上，一般用正丁醇︰水︰冰醋酸〔3︰1︰1〕展开晾干后，喷茚三酮的丙酮溶液显色，规定供试品所显杂质斑点的颜色不得深于对照液主斑点，以此限制其他氨基酸的含量。25整理课件第一节

氨基酸类药品检验氨基酸和有些小分子多肽药物是经过酶解或化学方法裂解大分子蛋白后经层析或超滤等方法得到的小分子物质，因此检查是否存在大分子蛋白质非常重要。方法：取适宜浓度的样品溶液，加等体积的20％磺基水杨酸溶液，溶液不发生浑浊那么判定无蛋白质。26整理课件第一节

氨基酸类药品检验2、平安性检查影响氨基酸平安用药的因素除其中的一般杂质，主要为热原的含量。中国药典所收载的氨基酸根本上都规定了热原检查。采用家兔法，将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在规定时间内观察家兔体温升高的情况，以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定。27整理课件第一节

氨基酸类药品检验三、氨基酸含量测定1、茚三酮法茚三酮法是氨基酸定量测定应用最广泛的方法之一。当茚三酮在酸性条件下和氨基酸反响时，氨基酸被氧化分解生成醛，放出氨和二氧化碳，水合茚三酮那么成复原型水合茚三酮。然后复原型茚三酮与氨，另一分子茚三酮进一步缩合生成蓝紫色物，最大吸收值的波长为570nm。28整理课件第一节

氨基酸类药品检验茚三酮反响为一切α-氨基酸所共有，反响灵敏，根据反响所生成的蓝紫色深浅，可以测定氨基酸含量。本法可允许的测定范围是0.5～50μg氨基酸。该法又分为Yemm法、Rosen法和Hydrindantin法。29整理课件第一节

氨基酸类药品检验〔1〕Yemm法取样品1.0mL〔含0.02～0.5µmol/L氨基酸〕，加枸橼酸缓冲液〔枸橼酸21g溶于100ml水中，加1.0mol/L氢氧化钠溶液200mL，加水至500mL〕0.5mL，茚三酮溶液〔茚三酮2.5g溶于50mL甲基溶纤剂中〕0.2mL，氰化钾溶液〔0.01mol/L氰化钾溶液5mL与25mL甲基溶纤剂混合〕1.0mL，充分混匀，沸水浴加热15min，冷却。参加稀释剂3～5mL，于570nm波长处测定。按标准曲线计算出含氨基酸的量。如所测氨基酸种类不明时，可用亮氨酸作标准曲线。30整理课件第一节

氨基酸类药品检验〔2〕Rosen法该法是Yemm法的改进。取样品1.0mL，加茚三酮溶液〔茚三酮3g溶于100mL甲基溶纤剂中〕及氰化钠溶液〔氰化钠490mg溶于1L水中，取该溶液20mL，加醋酸缓冲液至1L〕各0.5mL，充分混匀，沸水浴加热15min，立即加50％〔V/V〕异丙醇，充分搅拌，放冷，比色，计算。〔3〕Hydrindantin法取茚三酮20g及茚烷酮〔Hydrindantin〕3g溶于750mL甲基溶纤剂及4mol/L醋酸缓冲液〔醋酸钠272g溶于适量水中，加冰醋酸50mL，加水至500mL〕250mL中，混合作为显色指示剂。取样品1～2mL，加等量显色指示剂，以下操作同上法。31整理课件第一节

氨基酸类药品检验2、三硝基苯磺酸〔TNBS〕法三硝基苯磺酸〔TNBS〕是定量测定氨基酸的重要试剂之一。TNBS在偏碱性的条件下与氨基酸反响，先形成中间络合物〔带有等摩尔〕，如下式。32整理课件第一节

氨基酸类药品检验中间络合物在光谱下有两个吸收值相近的顶峰，分别位于355nm和420nm附近。溶液一旦酸化，中间络合物转化成三硝基苯氨基酸〔TNP氨基酸〕，420nm处的吸收值显著下降，而350nm附近的吸收峰那么移至340nm处。33整理课件第一节

氨基酸类药品检验利用TNBS与氨基酸反响的这一特性，可在420nm处〔偏碱性溶液中〕或在340nm〔偏酸性溶液中〕对氨基酸进行定量测定。本法允许的测定范围是0.05～0.4μmol氨基酸。34整理课件第一节

氨基酸类药品检验3、铜复合物紫外吸收法在适宜的pH值条件下，2molα-氨基酸与1mol铜离子形成氨基酸-铜复合物：35整理课件第一节

氨基酸类药品检验此复合物呈蓝色，除了在620nm有吸收峰外，在230nm有最大吸收，其摩尔吸收系数在230nm处为620nm处的100倍左右，因此利用氨基酸-铜复合物的紫外吸收以进行氨基酸的微量测定。本法可允许测定范围是50～500μmol/mL的氨基酸。适用于蛋白质水解速率和水解程度的测定。36整理课件第一节

氨基酸类药品检验4、甲醛滴定法氨基酸的NH3+基的pK值常在9.0以上，不能用一般指示剂作酸碱滴定测定。但甲醛可与氨基酸中不带电荷的氨基相互作用，促使NH3+上的氢离子释放。37整理课件第一节

氨基酸类药品检验在pH值中性和常温条件下，甲醛迅速与氨基酸上的氨基〔或亚氨基〕结合，使下述平衡向右移动，促进氢离子释放，使溶液酸度增加。即可用酚酞作指示剂，以氢氧化钠来滴定。每释放出一个氢离子，就相当有一个氨基氮，从滴定所用氢氧化钠量可以计算样品中氨基氮含量以及氨基酸含量。38整理课件第一节

氨基酸类药品检验5、非水溶液滴定法中国药典、美国药典和英国药典对所收载氨基酸类药物，除谷氨酸用氢氧化钠为标准溶液的酸碱滴定法，其余均根据其结构特性，采用了非水酸碱滴定法。用冰醋酸作溶剂，高氯酸作标准溶液滴定，电位法或指示剂法确定终点。适用于常量氨基酸的含量测定。39整理课件第一节

氨基酸类药品检验40整理课件第一节

氨基酸类药品检验〔1〕直接滴定法适用于能溶于冰醋酸的氨基酸。精密称定氨基酸样品约50mg，溶于20ml冰醋酸中，加2滴甲基紫指示剂，用高氯酸标准液滴定。终点为紫色消失，呈现蓝色，计算，即得。用直接法测定的氨基酸有丙氨酸、精氨酸、组氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、苏氨酸等。谷氨酸和门冬氨酸在高氯酸中不溶解，可将样品溶于2mL甲酸中，再加20mL冰醋酸，直接用标准高氯酸溶液滴定。41整理课件第一节

氨基酸类药品检验〔2〕回滴法适用于不易溶于冰醋酸而能溶于高氯酸的氨基酸。精密称定氨基酸样品约30-40mg，溶于5mL高氯酸标准液中，加2滴甲基紫指示剂，用醋酸钠溶液滴定剩余的酸，颜色由黄至绿至蓝至初次呈现不褪色的紫色为终点，计算，即得。用回滴法测定的氨基酸有赖氨酸、丝氨酸、半胱氨酸等。42整理课件第一节

氨基酸类药品检验6、双波长分光度法双波长分光光度法的理论根底是差吸光度和等吸收波长。它采用测量波长〔主波长λp,PrimaryWavelength〕和参比波长〔次波长λs,SecondWavelength〕两个不同波长同时测定一个样品溶液，可以克服单波长测定的缺点，提高了测定结果的精密度和准确度。待测溶液在λp与λs两个波长处测定的差吸光度ΔA与试样中待测物质的浓度C成正比。43整理课件第一节

氨基酸类药品检验复方氨基酸注射液中，采用双波长分光光度法测定氨基酸的含量，可消除共存组分干扰原理，不经别离直接测定，操作简便、准确。色氨酸测定波长280nm，酪氨酸等吸收波长303nm。酪氨酸测定波长240nm，色氨酸等吸收波长292nm。44整理课件第一节

氨基酸类药品检验7、导数分光光度法在一定条件下，溶液组分的吸光度对波长的微分值与组分浓度仍保持线性关系，利用吸光度导数光谱可以定量测定组分含量，称为导数分光光度法。导数光谱数值测定有三种方法：切线法，峰谷法，峰零法。45整理课件第一节

氨基酸类药品检验①根据紫外吸收光谱选定导数光谱波长范围〔应包含被测组分的最大吸收波长〕。②按导数分光光度法测定被测混合组分的一阶、二阶和三阶导数光谱。③选取其中能排除干扰组分干扰的导数光谱。④在被测组分的最大吸收波长处用切线法〔或峰谷法、峰零法〕量得的振幅值D与标准品浓度做标准曲线。⑤测定样品在最大吸收波长下的振幅值D，代入回归方程，计算样品浓度。46整理课件第一节

氨基酸类药品检验用二阶导数光谱法测定复方氨基酸中色氨酸含量，浓度范围在9-45μg·ml-1时,呈良好线性。平均回收率100.43%,RSD为0.44%。47整理课件第一节

氨基酸类药品检验8、酰胺氮测定法双羧基氨基酸〔谷氨酰胺、天〔门〕冬酰胺〕的侧链上含有酰胺基。酰胺基上的氮比较容易释放，在较温和或短时间的水解条件下，即可释放完全。RCONH2+2H2ORCOOH+NH4OH氨被释放出来，经过弥散，吸收于中央室含有指示剂的酸溶液中。反响完全后，直接在中央室用标定过的盐酸滴定，即可标出酰胺氮的含量，间接可求出氨基酸的含量。48整理课件第一节

氨基酸类药品检验9、酸碱滴定法赖氨酸〔lysine〕片中赖氨酸的测定取本品20片，精密称定，研细，精密称取适量〔约相当于赖氨酸0.15g〕置烧杯中，加水25mL，滴加氢氧化钠滴定液〔0.1mol/L〕，用酸度计调节至pH值为7.0，参加预先调节至pH值9.0的甲醛溶液15mL，搅匀，再用氢氧化钠滴定液〔0.1mol/L〕滴定至pH值为9.0，并持续30s。按参加甲醛液后所耗用氢氧化钠滴定液〔0.1mol/L〕体积计算，每毫升氢氧化钠滴定液〔0.1mol/L〕相当于9.132mg的C6H14N2O2·HCl。49整理课件第一节

氨基酸类药品检验10、HPLC对于各种复方氨基酸制剂中氨基酸的含量测定，目前较多地采用了高效液相色谱法〔HPLC〕。因大多数氨基酸没有紫外吸收，不能用紫外检测器测定。为改善被测物的检测特性，提高检测灵敏度，需进行化学衍生化。衍生方式包括柱后衍生法和柱前衍生法。柱后衍生法是将样品经离子交换柱别离后进行衍生；柱前衍生法是将样品制成适当的衍生物再进行HPLC别离。50整理课件第一节

氨基酸类药品检验衍生可改善被测物的检测特性，且可改变别离选择特性，经衍生化的氨基酸可用紫外或荧光检测器检测。据文献报道，用邻苯二甲醛柱前衍生和荧光检测的反相高效液相色谱法测定复方氨基酸注射剂中氨基酸含量，检测限为pg水平。用异硫氰酸苯酯柱前衍生紫外检测反相HPLC定量测定植物中氨基酸含量，检测限8.11-13.3pmol/μL。用亚硝酸衍生化，紫外检测的反相HPLC定量测定人体内的乙酰半胱氨酸，检测限为170nmol。用N-芘基马来酰亚胺修饰N-乙酰半胱氨酸，用荧光检测的反相HPLC测定，定量限为32nmol。51整理课件第一节

氨基酸类药品检验11、其他仪器分析方法其他一些仪器分析方法也可用于氨基酸的含量测定。如杜鸣等在荧光计上附加互相垂直的偏振片消除溶剂散射光的影响和苯丙氨酸的干扰，用偏振荧光光度法同时测定氨基酸注射液及动植物浸出液中酪氨酸和色氨酸的含量。52整理课件第二节

多肽因子类和蛋白质类药品检验蛋白质和多肽因子是生物体内广泛存在的生化物质，具多种生理功能，是一大类非常重要的生化药物。蛋白质是呈两性解离的电解质，其离子基因除末端氨基和末端羧基外，还有侧链上的酸性或碱性基团，各种蛋白质分子有各自的等电点，在等电点时蛋白质的溶解度最小，稳定性差，易从溶液中沉淀析出。蛋白质对水亲和力很大，在可水溶液中形成亲水胶体。蛋白质分子构象受热、超声波、紫外光照射等物理因素和酸、碱、重金属、有机溶剂等因素的影响而变化。蛋白质变性后失去生物活性和结晶能力，同时黏度、溶解度、沉降系数和扩散系数也会发生变化。53整理课件第二节

多肽因子类和蛋白质类药品检验多肽因子类药物指分子量不算太大的，在体内含量极微，但却发挥极大生理作用的一类生物活性物质。其中包括天然动物体内提取的药物如干扰素、白细胞介素、胸腺肽、转移因子等和通过现代基因工程技术生产的药品如重组人干扰素、重组白细胞介素、重组乙肝疫苗等。天然来源的多肽因子药物〔如胸腺肽、转移因子等〕其分析方法与蛋白质类药物的分析方法根本相同。以基因工程重组技术生产的多肽因子类药物分析方法与蛋白质类药物的分析方法差异较大。54整理课件第二节

多肽因子类和蛋白质类药品检验一、多肽因子类药物的定性鉴别基因重组多肽因子类药物的鉴别主要采用SDS法和免疫印迹法。1、SDS法用SDS鉴别生物样品必须是该品有极纯的标准对照品，通过电泳结果的比照，确定所测样品是否与标准品有相同的迁移率，从而鉴别该品。缺点：必须有标准品；凝胶中多肽需保存生物活性，或能够复性，或电泳前可将检测配基与待测多肽共价交联。55整理课件第二节

多肽因子类和蛋白质类药品检验2、蛋白质免疫印迹电泳法〔转移电泳、westernblot〕原理：借助聚丙烯酰胺凝胶技术，将生物活性物质高效别离，别离后的样品可以原位、定量驱动或吸印在另一种固相载体〔通常用醋酸纤维素薄膜，简称NC膜〕上，能保持原有的生物活性，可以进行各种生物检测、免疫识别、扫描、积分和保存。56整理课件第二节

多肽因子类和蛋白质类药品检验〔1〕根本操作分3个局部：聚丙烯酰胺凝胶电泳；转移电泳〔即将凝胶中的多肽条带转移到硝酸纤维素纸上〕；检测或鉴定薄膜上的多肽条带。①聚丙烯酰胺凝胶电泳先将待别离样品进行凝胶电泳别离。凝胶可用琼脂糖凝胶，也可用聚丙烯酰胺凝胶，可以是均一的，也可用梯度凝胶，凝胶缓冲体系中可含有各种变性剂，如SDS、LDS、尿素等，可进行单向或双向电泳，也可用等电聚焦电泳。57整理课件第二节

多肽因子类和蛋白质类药品检验②转移电泳将湿醋酸纤维素〔NC〕薄膜紧贴凝胶，凝胶与薄膜之间不能有气泡，否那么在气泡所在部位的条带将不能转移，在NC膜和凝胶的另一侧放上两层湿滤纸，也不能有气泡，再在两边贴上海绵，最后用塑料网框架夹紧，插入电泳槽，根据凝胶中样品所带电荷的性质，决定有NC膜的一边是靠近正极还是靠近负极一侧。电泳条件取决于凝胶类型、转移装置和蛋白质本身性质等。一般采用低电压和低电流〔2mA/cm2以内〕。缓冲液中一般含有20％的甲醇或乙醇，其作用主要是保持凝胶的几何形状。58整理课件第二节

多肽因子类和蛋白质类药品检验③检测或鉴定NC膜借助非共价键吸附蛋白质，经转移后蛋白质条带就固定在NC膜上，完全保存凝胶中的蛋白谱，可直接用考马斯亮蓝、氨基黑10B等染色。如果利用蛋白质生物活性，或用蛋白质生物探针来检测，就要先用1％～3％的牛血清蛋白或血红蛋白，或非离子去垢剂〔0.3％吐温-20〕等处理NC纸，以封闭NC纸上未吸附蛋白质区域，使其不再能吸附蛋白质。使用非离子去垢剂比较经济，但有可能把NC纸上的某些蛋白质洗掉，同时还要将NC纸反复洗涤以去除变性剂，59整理课件第二节

多肽因子类和蛋白质类药品检验使蛋白质恢复到天然态或生物活性，然后再与检测探针保温。如用ConA〔伴刀豆球蛋白A〕检测糖蛋白，用抗体检测其特异性的抗原，用激素检测其特异受体，用底物检测特异的酶等。如探针本身具有放射性〔如125I标志ConA〕，或连有酶〔如酶标抗体〕，或荧光探针，那么反响后应彻底洗涤，可立即进行放射自显影，或与底物来反响，或紫外灯下观察荧光。60整理课件第二节

多肽因子类和蛋白质类药品检验二、多肽因子类药物的检查1、分子量检查常用复原型SDS法检查分子量，用量约1μg。也可采用凝胶过滤法，例如Sephadecx系列〔G-75，-100〕；waters1～60，125，250；BackmanTSK2000SW，3000SW，4000SW。凝胶过滤是测定完整蛋白质分子的分子量，而SDS是测定蛋白质亚基的分子量，同时用这二种方法测定同一蛋白质的分子量，可以方便地判断样品蛋白质是否是寡聚蛋白质。61整理课件第二节

多肽因子类和蛋白质类药品检验2、肽图分析肽图分析是指用酶解或化学降解蛋白质后，对生成的肽段进行别离、分析的技术。〔1〕蛋白质的裂解方法①酶解法应用蛋白酶裂解蛋白质，利用各种蛋白酶对蛋白质分子肽键作用的特异性。如胰蛋白酶作用于碱性氨基酸〔精氨酸和赖氨酸〕的羧基端，酶解有时不完全，在此情况下，可加一些变性剂〔4mol尿素〕；或用复原剂DTT复原，再用烷化剂〔碘代乙酸〕烷化成羧甲基半胱氨酸，它能很好地和方便地进行氨基酸定量分析。62整理课件第二节

多肽因子类和蛋白质类药品检验②化学裂解法最常用的是溴化氰裂解法。溴化氰作用于Met羧基端和其次一个氨基酸形成的肽键，如γ-干扰素含4个Met，经溴化氰作用后生成5个肽段。其他化学裂解法还有BNPs-3-甲基吲哚，N-氰代琥珀酸亚胺等作用于Try-x键；2-硝基-5-硫氰基苯甲酸作用于x-Cys键；羟胺作用于Asp-Glu键；稀酸〔吡唑醋酸〕作用于Asp-Pro键。63整理课件第二节

多肽因子类和蛋白质类药品检验〔2〕肽图分析最早称为Fingerprinting〔指纹术〕，用在镰形细胞贫血症研究中。将HbA〔血红蛋白A〕和HbS〔血红蛋白S〕的分别用胰蛋白酶酶解，然后将它们分别进行电泳，再转动90°进行纸层析。Ingram用此法观察到HbA和HbS之间有一个肽斑点上的差异，进一步的肽顺序分析指出这仅是β珠蛋白链第6位上一个氨基酸残基的差异，HbA中为Glu〔谷氨酸〕，HbS中为Val〔缬氨酸〕。64整理课件第二节

多肽因子类和蛋白质类药品检验肽图分析最常用的方法有SDS电泳法、高效液相色谱法〔HPLC〕和毛细管电泳法〔CE〕。HPLC主要是用反相柱，根据肽段的长短和疏水性来别离，如果亲水性太强，那么难于在柱上滞留而达不到别离效果；如果肽的疏水性很强，又难于洗脱下来，而CE法那么可防止这些缺点。65整理课件第二节

多肽因子类和蛋白质类药品检验3、等电点测定等电点是蛋白质的物理化学常数，它表示蛋白质的带电性质。一般采用凝胶等电聚焦电泳技术测定等电点。4、紫外吸收不同的蛋白质分子都有其特定的紫外吸收，对于某种蛋白质或多肽来说，它的最大吸收波长是固定的。紫外吸收光谱是检查蛋白质的一个重要指标。66整理课件第二节

多肽因子类和蛋白质类药品检验5、纯度基因工程产品蛋白质纯度是一项重要指标，但它也是一项相对的指标，需根据实际要求而定。蛋白质纯度一般是指是否含有其他杂蛋白，而不包括盐、缓冲液离子、SDS等小分子在内。目前较常用的是HPLC法〔包括凝胶过滤、各种反相HPLC、离子色谱、疏水色谱等〕、非复原SDS凝胶电泳法、毛细管电泳法〔CE〕、等电聚焦电泳，此外也应用一些化学方法，观察末端是否均一。67整理课件第二节

多肽因子类和蛋白质类药品检验至少应用两种以上的方法，而且是两种不同别离机理的方法来判定蛋白质的纯度才比较可靠。常发现某一样品在凝胶过滤中是纯的，而在离子色谱中却分辨为二个组分，反之亦然。又如一种样品用凝胶过滤法和SDS电泳证明是纯的，但这仍不充分，因为这两者机理相同。68整理课件第二节

多肽因子类和蛋白质类药品检验6、N-端氨基酸序列测定测定蛋白质或多肽的氨基酸序列是鉴别蛋白质的重要指标。50年代初，Edman采用异硫氰苯酯〔PhenylisothioCyanate，简称PITC，Edman试剂〕首先建立了测定蛋白质的氨基酸序列的方法。1968年，Edman研制成功自动顺序仪〔Secluencer〕。近年来，又有高度自动化、微量化的精确灵敏的气液顺序仪问世。在各种测定蛋白质氨基酸序列方法中，Edman降解法仍是最为准确、可靠的方法。69整理课件第二节

多肽因子类和蛋白质类药品检验〔1〕原理Edman试剂的化学反响，从蛋白质的多肽链的N-端进行降解，一次只去掉一个氨基酸残基，经过反复循环反响，能依次得到一系列苯氨基硫甲酰氨基酸〔PTH-氨基酸〕，分析鉴定PTH-氨基酸就可得到从肽N-端开始的氨基酸序列。主要反响分为三步：①偶合蛋白质多肽链N-端氨基酸与PITC在无氧条件下，在pH8-9的缓冲液中进行偶合，生成苯基硫代氨甲酰基肽衍生物。70整理课件第二节

多肽因子类和蛋白质类药品检验②裂解苯基硫代氨甲酰基肽的衍生物与无水三氟醋酸反响，释放出N-端的氨基酸，产生苯胺噻唑啉酮〔anilinothiazolinone，ATZ〕衍生物和减少一个残基的多肽链。③转位生成的ATZ衍生物极不稳定，必须迅速转化成苯基乙内酰硫脲-氨基酸〔Phenylthiohydantion，简称PTH〕后，进行鉴定。71整理课件第二节

多肽因子类和蛋白质类药品检验〔2〕样品的处理①首先必须将蛋白质样品进行解聚成一条多肽长链分子。如果测定的样品分子中含有二硫键，必须将二硫键用氧化复原法拆开，得到含半胱氨酸的肽链还必须加以保护，防止二硫键重新聚合。含亚基的蛋白质分子，需将亚基拆开、纯化、分别测量。72整理课件第二节

多肽因子类和蛋白质类药品检验②蛋白质多肽链的N-端必须是游离基团。有些蛋白质N-端被乙酰基〔CH3CO－〕封闭，如乙酰细胞色素C、乙酰烟草花叶病毒等。有的蛋白质N-端为环谷氨酸〔pyroglutamicacid〕，如兔IgG的重链、许多活性多肽等，都不能直接用Edman法降解。73整理课件第二节

多肽因子类和蛋白质类药品检验③影响偶合反响的因素必须严格控制pH在8-9；过碱会导致PITC与一级胺、二级胺反响，从而影响PTH-氨基酸鉴定；偏酸将导致偶合反响不完全。严格控制在无氧条件下进行；氧化将导致二硫磺酸副产物的生成，及色氨酸被氧化而使反响终止。用高纯度缓冲液，各种试剂也必须经过再纯化；杂质中含醛会造成氨基被反响，以及形成Sehiff碱使蛋白质多肽链产生不纯的联结肽，而造成肽链氨基酸序列测定中断。控制反响时间及温度；延长反响时间和提高温度，都将导致副反响增加而影响测定。74整理课件第二节

多肽因子类和蛋白质类药品检验〔3〕检测过去常用薄层层析法进行鉴定检查，但该法操作非常复杂，时间长，灵敏度和精确度都很差。近年来，大局部实验均采用高效液相法鉴定PTH-氨基酸，它既可定性又可定量，是目前最精确的方法。75整理课件第二节

多肽因子类和蛋白质类药品检验7、外源DNA含量测定基因工程产品在生产过程中，可能会因操作不当将DNA片段代入样品中，所以必须对样品进行外源残留DNA含量测定。一般规定剩余DNA含量每个剂量小于100pg。通常用改进的Southern杂交法，又称为斑点杂交〔Dotblot〕，即直接将被测样品点于醋酸纤维素膜上使之成为斑点，然后与探针DNA进行杂交，最后与标准DNA同样操作的结果比照，以确定剩余外原DNA的含量。76整理课件第二节

多肽因子类和蛋白质类药品检验标记DNA常用放射性核素标记，利用放射自显影技术进行定量测定。近年来，试剂盒为实验带来了更大的方便。例如，BOEHTINGERMANNHEIM公司出品的地高辛标记的DNA标记检测试剂盒，它是通过无放射标记的地高辛与标记的DNA结合经杂交而形成的有颜色或荧光的检测物质。地高辛与dUTP经强碱作用形成新的复合物DIG-11-UDP标记物，该标记物与膜上的被检测DNA杂交显色而被测定。77整理课件第二节

多肽因子类和蛋白质类药品检验剩余DNA的测定方法：〔1〕样品①DNA标准品〔一般采用发酵用的工程菌DNA稀释〕：10ng/mL、1ng/mL、100pg/mL、1pg/mL。②将待测样品用蛋白酶K，37℃消化4h。〔2〕DNA变性将样品置沸水浴中加热2min，然后迅速置冰水中冷却。〔3〕点样将经变性处理的样品点于枯燥的醋酸纤维素膜上〔1μL/点〕，紫外灯下照射5min。〔4〕预杂交将膜置于塑料袋内，参加10mL标准杂交液，封口，68℃孵育过夜。78整理课件第二节

多肽因子类和蛋白质类药品检验〔5〕杂交塑料袋内参加标的探针DNA50μL，68℃孵育6h。〔6〕洗膜、孵育、封闭、漂洗。〔7〕在10mL检测平衡液中平衡膜5min。〔8〕在10mL新鲜配制的显色液中，孵育至膜显色完全为止。79整理课件第二节

多肽因子类和蛋白质类药品检验8、剩余IgG含量测定有些基因工程蛋白质在工业生产中用单克隆抗体亲和层析法进行纯化，而在层析过程中，可能会有少量单克隆抗体被洗脱下来而混在纯化液中。这些单克隆抗体为异体大分子蛋白，如果混入样品，会给患者使用造成强烈过敏反响，因此必须进行单克隆抗体检查〔一般规定应小于100ng/支〕。免疫球蛋白〔IgG〕的测定方法有多种。用于定性分析的有SDS、等电聚焦电泳和免疫学方法；用于定量分析的有蛋白定量〔抗原定量〕。80整理课件第二节

多肽因子类和蛋白质类药品检验测定基因工程干扰素中的剩余IgG的方法：〔1〕将羊抗鼠IgG用包被液稀释至10μg/mL，每孔加100μL，37℃保温2h或4℃过夜。〔2〕每孔加100μL封闭液封闭，37℃保温30min。〔3〕将标准IgG稀释成100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、12.5ng/mL、6.25ng/mL、3.125ng/mL、1.563ng/mL的溶液，每孔加100μL。〔4〕样品每孔加100μL，37℃保温2h。81整理课件第二节

多肽因子类和蛋白质类药品检验〔5〕将HRP-羊抗鼠IgG以1︰800稀释后，每孔100μL，37℃保温30min。〔6〕将4mg邻苯二胺溶于10mL底物缓冲液中，加30％过氧化氢15μL，摇匀，每孔100μL，37℃保温30min。〔7〕每孔加2mol/L硫酸溶液50μL，终止反响。〔8〕用酶标仪测OD492值，计算剩余IgG含量。82整理课件第二节

多肽因子类和蛋白质类药品检验三、多肽因子类药物生物效价的测定生物制剂或生化制剂因受外界因素影响〔温度、湿度、时间、生产过程的各环节等〕而易导致其生物活性降低或全部丧失而失去药理作用，所以除要测定其含量外，还要测定其生物学活性以确定其是否具有体内或体外作用。1、免疫学测定法主要是采用ELISA定量测定样品的量。83整理课件第二节

多肽因子类和蛋白质类药品检验2、细胞病变抑制法该法主要用于干扰素的效价测定。一般采用CPE〔细胞致病效应〕抑制为根底的抑制微量测定法。〔1〕材料准备①测定细胞人羊膜细胞Wish株。②攻击病毒选用水泡性口腔炎病毒〔VSV〕作为攻击病毒，使用前先在选定测定细胞上滴定其CCID50，以感染24h后引起测定细胞出现“++〞cpe的病毒稀释度为1个CCID50，该病毒的滴度为稀释度的倒数乘10，单位为CCID50/mL。③完全培养液MEM培养液添加10％牛血清。④测定培养液MEM培养液添加7％牛血清。⑤攻毒培养液MEM培养液添加3％牛血清。84整理课件第二节

多肽因子类和蛋白质类药品检验〔2〕操作①铺板弃去Wish细胞培养瓶中培养液，用PBS洗2次后消化和收集细胞，用完全培养液配成约25万～35万个细胞/mL的细胞悬液，接种于96孔培养板上，每孔100μL，37℃，5％CO2，培养4～6h。②制备标准溶液取1支标准品用测定培养液稀释至1000U/mL。③制备样品溶液将待测样品用测定培养液稀释至1000U/mL。85整理课件第二节

多肽因子类和蛋白质类药品检验④另取96孔细胞培养板一块，每孔参加150μL测定培养液。在A6、A7各孔中每孔参加50μL标准溶液，在A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9、A10、A11各孔中每孔参加50μL各待检样品，每个待检样品做2个复孔。自A行取50至H行作4倍稀释，每孔留150μL余液。⑤加样取①项的细胞培养板，将④项制备的溶液移入该细胞培养板中，每孔100μL，37℃，5％CO2，培养18～24h。86整理课件第二节

多肽因子类和蛋白质类药品检验⑥制备病毒液攻击剂量为100TCID50，取保存的VSV用攻毒培养液稀释至工作浓度。⑦功毒取制备好的细胞培养板，弃去上清，参加病毒液，每孔100μL，37℃，5％CO2，培养24h〔镜检标准溶液的50％病变点在D或E行〕。⑧染色，脱色，以630nm为参比波长，在570nm波长处测定吸收度。87整理课件第二节

多肽因子类和蛋白质类药品检验〔3〕结果计算采用计算机程序或直线回归计算法进行计算处理。分别计算各试验样品的半效稀释倍数〔即从样品溶液至相当于标准品50％最大效应点的稀释倍数〕，并按下式计算：88整理课件第二节

多肽因子类和蛋白质类药品检验3、3H-TdR掺入同位素法原理：通过比较待测样品与标准品之间对检测细胞促增殖能力的强弱来确定待测样品的活性。在测试液中参加由3H标定的胸腺嘧啶〔3H-TdR，为细胞增殖过程中DNA合成的必备物质〕，3H-TdR掺入量就代表了细胞增殖能力的强弱。3H-TdR用同位素液闪计数仪来测定。该方法具有敏感性高、特异性强、稳定性好等优点。89整理课件第二节

多肽因子类和蛋白质类药品检验〔1〕CTLL-2细胞短期培养3H-TdR掺入法取传代第2-3d、生长旺盛的CTLL-2细胞，用RPMI1640培养液将细胞洗两次后，用含10％小牛血清、5×10-5mol/L2-巯基乙醇的RPMI1640培养液配成1×105/mL细胞悬液。用96孔细胞培养板，每孔中参加100μL不同稀释度的待测样品，同时设置培养液对照和各种浓度的标准品对照，再向各孔中参加100μL的CTLL-2细胞。90整理课件第二节

多肽因子类和蛋白质类药品检验置37℃、5％CO2孵箱中培养18h或24h，然后每孔中参加50μL的18.5kBq3H-TdR，继续培养4～6h。用多头细胞收集仪收集细胞，用液闪计数仪检测细胞的3H-TdR掺入值，通过比较待测样品与标准品使细胞掺入3H-TdR量的多少计算样品的活性。91整理课件第二节

多肽因子类和蛋白质类药品检验〔2〕鼠脾细胞增殖检测法无菌取C57BL/6小鼠脾脏制成单细胞悬液，以〔0.5～1.0〕×107/mL细胞浓度悬浮于含有5％小牛血清、5×10-5mol/L2-巯基乙醇、2.5μg/mLConA的RPMI1640培养液中培养48～72h。离心〔1500r/min、10min〕，弃去上清后参加0.05mol/Lα-甲基甘露糖苷，置40℃温育45min，然后用Hanks液将细胞洗两次，用含10％小牛血清、5×10-5mol/L2-巯基乙醇、0.1mol/Lα-甲基甘露糖苷的RPMI1640培养液配制成2×106/mL细胞悬液。92整理课件第二节

多肽因子类和蛋白质类药品检验用96孔细胞培养板，每孔参加100μL不同稀释度的待测样品，同时设置培养液对照和各种浓度的标准品对照，再向各孔中参加100μL的细胞悬液。置37℃、5％CO2孵箱中培养18h，然后每孔中参加50μL的18.5kBq3H-TdR，继续培养4～6h。用多头细胞收集仪收集细胞，用液闪计数仪检测细胞的3H-TdR掺入值，通过比较待测样品与标准品使细胞掺入3H-TdR量的多少计算样品的活性。93整理课件第二节

多肽因子类和蛋白质类药品检验〔3〕Ando氏微量测定法取肝素抗凝全血，经Ficoll-Hypaque密度梯度离心，取单个核细胞，用含10％小牛血清的RPMI1640培养液配成5×105/ml细胞悬液，置37℃、5％CO2孵箱中培养10天后，用Hanks液将细胞洗两次，用含10％小牛血清的RPMI1640培养液配成2×105/mL细胞悬液。用96孔细胞培养板，每孔参加100μL不同稀释度的待测样品，同时设置培养液对照和各种浓度的标准品对照，再向各孔中参加100μL的细胞悬液。置37℃、5％CO2孵箱中培养4d，然后每孔中参加74kBq3H-TdR，继续培养4h后，收集细胞，用液闪计数仪检测细胞的3H-TdR掺入值，计算样品的活性。94整理课件第二节

多肽因子类和蛋白质类药品检验4、微量酶检测法〔MTT〕法该法通过比较待测样品刺激检测细胞增殖能力的强弱来确定样品的活性。细胞增殖反映能量代谢活泼，可产生大量的能量，供合成多种大分子物质和细胞分裂所需，细胞能量代谢的水平与细胞合成DNA水平根本平行，因此，测定细胞能量代谢的水平可以间接地反映细胞的增殖情况。95整理课件第二节

多肽因子类和蛋白质类药品检验四甲基偶氮唑盐[3-〔4,5-dimethyhhiazol-2-y1〕-2,5-di-phenyhetrazoliumbromide，MTT]是一种淡黄色的可溶性化合物，活细胞特别是增殖期的细胞可通过线粒体能量代谢过程中的琥珀酸脱氢酶的作用使淡黄色的MTT分解产生蓝色结晶状Formazan沉积于细胞内或细胞周围，而且Formazan的量与细胞的增殖程度呈正比，Formazan经异丙醇作用后可溶解显色。96整理课件第二节

多肽因子类和蛋白质类药品检验Mosman等〔1983〕根据上述原理首创了MTT比色分析法用于检测能够刺激细胞增殖的生物样品的活性。〔1〕主要试剂MTT溶液将MTT按5mg/mL浓度溶解于PBS中，过滤除菌后，置4℃下避光保存。酸化异丙醇含0.04mol/L盐酸的异丙醇。97整理课件第二节

多肽因子类和蛋白质类药品检验〔2〕方法用含10％小牛血清的RPMI1640培养液将检测细胞〔例如CTLL-2或ConA活化的小鼠脾细胞〕配成5×105/mL细胞悬液。向96孔细胞培养板的每孔参加100μL上述细胞悬液，再取100μL不同稀释度的待测样品和各种浓度的标准品对照品分别参加各孔中，每个稀释度3个复孔，并同时设置培养液对照孔。置37℃、5％CO2孵箱中培养48h。98整理课件第二节

多肽因子类和蛋白质类药品检验离心〔1500r/min、5min〕，从各孔中轻轻吸取100μL上清液，弃去，各孔再参加10μLMTT溶液，置37℃、5％CO2孵箱中孵育4～6h。各孔中参加100μL酸化异丙醇，并充分混合，静置数分钟，让形成的Formazan充分溶解。在酶标仪上选择检测波长590nm、参考波长630nm测定OD值，将待测上清的OD值与标准品OD值比较，即得待测样品的活性。99整理课件第二节

多肽因子类和蛋白质类药品检验〔3〕MTT法的优点与3H-TdR掺入法相比，MTT法操作简便，测定时间大大缩短〔特别是一次性测定大量样品时〕，而且防止了使用放射性同位素和购置昂贵的设备，所需试剂仅是MTT和酸化异丙醇。100整理课件第二节

多肽因子类和蛋白质类药品检验〔4〕应注意的问题①酸化异丙醇后要在1h内进行测定，如1h内无法测定，可将未加酸化异丙醇的细胞培养板暂放在4℃中保存，测定前将细胞培养板取出，在室温放置数分钟后再参加酸化的异丙醇进行测定。②在每孔中含有100～50000个检测细胞时，细胞数与所测的OD值呈正相关。③因为酚红可以干扰OD值的测定，所以，MTT法最好选用无酚红的RPMI1640培养液，但这种培养液目前在我国难以购置，可以设置RPMI1640培养液对照孔以排除酚红的影响。101整理课件第二节

多肽因子类和蛋白质类药品检验〔5〕改进MTT法为了能更加简便、快速地一次测定大量样品，Tada等〔1986〕对MTT法在以下几方面进行了改进：①将加MTT前的培养时间从48h缩短为24h；②用10％SDS-0.01mol/LHCl代替酸化异丙醇溶解Formazan结晶，防止了人工混匀和异丙醇引起的小牛血清沉淀现象；③省掉离心，弃上清的过程，可在溶解Formazan结晶后5天内测定OD590值而变异值很小，而常规MTT法需在1h内比色测定。102整理课件第二节

多肽因子类和蛋白质类药品检验5、红细胞生成素〔EPO〕体外活性测定法〔ELISA测定法〕3H-TdR掺入法体外测定EPO具有简便、可靠、敏感的特点，可在24h内完成，检测灵敏度可达0.002U/mL。ELISA试剂盒测定法：〔1〕检测所用试剂盒为QUANTIKINEIVDEPOELISAR＆DSastemIncUSA。〔2〕将样品初步稀释至活性为20～200mU/mL〔采用3步稀释法〕。稀释后在微量震荡器上将样品混匀。103整理课件第二节

多肽因子类和蛋白质类药品检验〔3〕按照试剂盒说明书进行操作：①在微孔板上每孔加100μLEPO稀释溶液。②在上述微孔中分别参加100μL不同浓度的标准品及稀释后的样品。③用薄膜封闭微孔，将微孔板置于室温孵育2h。④吸去微孔中的液体，每孔加200μL结合液。⑤用薄膜封闭微孔，将微孔板置于室温孵育2h。⑥吸去微孔中的液体，每孔加300μL清洗液清洗4次。104整理课件第二节

多肽因子类和蛋白质类药品检验⑦每孔加200μL基底溶液〔substrateSolution〕〔必须在配制后15min内使用〕，注意不要加出气泡。⑧将微孔板置于室温孵育25min。⑨每孔加100μLSubstrateStopSolution终止反响。⑩将微孔板置于酶标仪上，在450nm波长处测OD值。最后，根据标准品的浓度和OD值求标准曲线方程，计算样品的浓度即体外活性。105整理课件第二节

多肽因子类和蛋白质类药品检验6、EPO体内生物学活性测定法〔网织红细胞计数法〕本法以给药小鼠后，取血涂片计数网织红细胞和红细胞数，并计算两者的比值并经过统计学处理来计算样品的体内活性。〔1〕选择6～7周，体重18～20g雌性小鼠，随机分组，每组6只。〔2〕标准品和样品各设3个剂量组，每个剂量组用2只鼠。分别做好标志。〔3〕将EPO标准品和待测样品分别用生理盐水稀释成30U/mL，稀释过程中加100μL白蛋白做保护剂。106整理课件第二节

多肽因子类和蛋白质类药品检验〔4〕连续三天给小鼠皮下注射EPO，剂量分别为2U/只、4U/只、8U/只。〔5〕于第四天由每只小鼠眼眶采血，分别做涂料片。滴2～3滴鲜血于涂有煌焦油兰〔1％乙醇染液〕的载玻片上，混匀，染色数分钟后推片。〔6〕血涂片进一步用瑞氏色素〔1︰600甲醇染液〕复染数分钟。〔7〕用pH6.8磷酸盐缓冲液冲洗干净，自然晾干。〔8〕在显微镜油镜下计数网织红细胞数和红细胞数，并计算两者的比值。〔9〕将上述所得数据进行统计学处理，计算EPO体内活性。107整理课件第二节

多肽因子类和蛋白质类药品检验四、蛋白质类药物的鉴别和检查1、蛋白质类药物的鉴别蛋白质类药物可根据其各自的物理、化学性质、生理作用等采用不同的方法进行鉴别。〔1〕茚三酮反响组成蛋白质的氨基酸都能与茚三酮反响生成紫色化合物，因此蛋白质也有此反响，这是蛋白质鉴别的最常用方法。〔2〕福林酚反响或双缩脲反响这两种常用来测定蛋白质的含量，但有时也用于蛋白质的鉴别。〔3〕紫外吸收由于组成蛋白质的氨基酸中，酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸在紫外区的光吸收特性，因此可利用此种特性鉴别蛋白质。108整理课件第二节

多肽因子类和蛋白质类药品检验五、蛋白质含量测定和效价测定1、蛋白质含量测定蛋白质的定量可用化学方法如凯氏定氮法、双缩脲法、福林酚法、紫外光吸收法来测定；也可用染色法，如氨基黑、考马斯亮蓝测定；此外还可用荧光激发、氯胺T、放射性核素计数等灵敏度较高方法。上述方法中凯氏定氮法、福林酚法、紫外光吸收法最为常用，它们操作简单、设备廉价。109整理课件第二节

多肽因子类和蛋白质类药品检验〔1〕凯氏定氮法凯氏定氮法常用来测定有机物的含氮量。①原理：A、含氮有机物的消化当含氮有机物与硫酸共热时，分解出氮、二氧化碳、水。氮转变出的氨与硫酸化合生成硫酸铵。分解反响进行得很慢，可参加硫酸铜及硫酸钾或硫酸钠促进反响，其中硫酸铜为催化剂，硫酸钾或硫酸钠可提高沸点。过氧化氢也能加速反响。110整理课件第二节

多肽因子类和蛋白质类药品检验B、铵离子的生成消化完了以后，在凯氏定氮瓶中参加强碱〔氢氧化钠溶液〕消化液，使硫酸铵分解，放出氨。用水蒸汽蒸馏法，将氨蒸入过量的硼酸溶液中，氨与溶液中的氢离子结合，生成铵离子，使溶液中氢离子浓度降低。C、测定用强酸滴定，直至恢复溶液中原来的氢离子浓度为止。所用强酸的摩尔数即相当于被测样品中氨的摩尔数。111整理课件第二节

多肽因子类和蛋白质类药品检验112整理课件第二节

多肽因子类和蛋白质类药品检验②操作方法常用的凯氏定氮法分为常量法和半微量法两种。A、常量法取被测样品适量〔含氮量约25～30mg〕，精密称定，样品如为固体或半固体，可用滤纸称取，并连同滤纸置于燥的500mL凯氏烧瓶中；113整理课件第二节

多肽因子类和蛋白质类药品检验依次参加硫酸钾〔或无水硫酸钠〕10g和硫酸铜粉末0.5g，再沿瓶壁缓缓加硫酸20mL；在凯氏烧瓶口放一小漏斗并使烧瓶成45°斜置，用直火缓缓加热，使溶液的温度保持在沸点以下，等泡沸停止，强热至沸腾，待溶液成澄明的绿色后，继续加热30min，放冷。114整理课件第二节

多肽因子类和蛋白质类药品检验沿瓶壁缓缓加水250mL，振摇混合，放冷后加40％氢氧化钠溶液75mL，注意使沿瓶壁流至底部，自成一液层，加锌粒数粒，用氮气球将凯氏烧瓶与冷凝管连接；另取2％硼酸溶液50mL，置500mL锥形瓶中，加甲基红-溴甲酚绿混合指示液10滴；115整理课件第二节

多肽因子类和蛋白质类药品检验将冷凝管下端插入硼酸溶液中，轻轻摆动凯氏烧瓶使溶液混合均匀，加热蒸馏，至接收液总体积为250mL时，将冷凝管尖端提出液面，使蒸汽冲洗1min，用水淋洗尖端后停止蒸馏；馏出液用盐酸滴定液〔0.1mol/L〕滴定至溶液由蓝绿色变为灰紫色，并将滴定结果用空白试验校正。每1mL盐酸滴定液〔0.1mol/L〕相当于1.401mg的N。116整理课件第二节

多肽因子类和蛋白质类药品检验B、半微量法图中A为1000mL圆底烧瓶，B为平安瓶，C为连有氮气球的蒸馏器，D为漏斗，E为直形冷凝管，F为100mL锥形瓶，G、H为橡皮夹。连接装置，A瓶中加水适量与甲基红指示液数滴，加稀硫酸使成酸性，加玻璃珠或沸石数粒。117整理课件第二节

多肽因子类和蛋白质类药品检验从D漏斗加水约50mL，关闭G夹，开放冷凝水，煮沸A瓶中的水，当蒸汽从冷凝管尖端冷凝而出时，移去火源，关H夹，使C瓶中的水反抽到B瓶中，开G夹，放出B瓶中的水，关B瓶及G夹，将冷凝管尖端插入50mL水中，使水自冷凝管尖端反抽至C瓶，再抽至B瓶，如上法放出。如此将仪器洗涤2～3次。118整理课件第二节

多肽因子类和蛋白质类药品检验取被测样品适量〔含氮量约1～2mg〕，精密称定，置枯燥的30～50mL凯氏烧瓶中，加硫酸钾〔或无水硫酸钠〕0.3g与30％硫酸铜溶液5滴，再沿瓶壁滴加硫酸2.0mL；在凯氏烧瓶口放一漏斗，并使烧瓶成45°斜置，用小火缓缓加热使溶液保持在沸点以下，等泡沸停止，逐步加大火力，沸腾至溶液成澄明的绿色后，继续加热10min，放冷，加水2mL。119整理课件第二节

多肽因子类和蛋白质类药品检验取2％硼酸溶液10mL，置100mL锥形瓶中，加甲基红-溴甲酚绿混合指示液5滴，将冷凝管尖端插入液面下；将凯氏烧瓶中内容物经由D漏斗转入C蒸馏瓶中，用水少量淋洗凯氏烧瓶及漏斗数次；参加40％氢氧化钠溶液10mL，用少量水再洗漏斗数次；120整理课件第二节

多肽因子类和蛋白质类药品检验关G夹，加热A瓶进行蒸汽蒸馏，至硼酸液开始由酒红色变为蓝绿色时起，继续蒸馏约10min，将冷凝管尖端提出液面，使蒸汽继续冲洗约1min，用水淋洗尖端后停止蒸馏。121整理课件第二节

多肽因子类和蛋白质类药品检验馏出液用盐酸滴定液〔0.01mol/L〕滴定至溶液由蓝绿色变为灰紫色，并将滴定结果用空白试验校正〔空白和供试品所得馏出液的容积应根本相同，约70～75mL〕。每1mL盐酸滴定液〔0.01mo1/L〕相当于0.1401mg的N。122整理课件第二节

多肽因子类和蛋白质类药品检验〔2〕双缩脲法双缩脲法分为常量法和微量法。①常量双缩脲法蛋白质含有多个肽键，因此有双缩脲反响，在碱性溶液中蛋白质与铜离子形成紫红色化合物，可在540nm比色测定，其颜色深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质的分子量及氨基酸组成无关，该法测定范围为1～10mg蛋白质/mL。双缩脲法常用于需要快速的测定，硫酸铵不干扰此显色反响，使其有利于对蛋白质纯化早期步骤的测定。干扰此测定的物质有Tris及含氨基酸、多肽的缓冲液，以及蔗糖、甘油等。123整理课件第二节

多肽因子类和蛋白质类药品检验A、溶液的配制蛋白质标准溶液：准确量取经真空枯燥的标准蛋白质〔牛血清白蛋白〕，用水配制成10mg/mL的溶液，如果蛋白质不易溶解，可用0.05mol/L氢氧化钠溶液配制，也可稍微加热或放置过夜以助溶。双缩脲试剂称取1.5g硫酸铜〔CuSO4·5H2O〕，6g酒石酸钾钠〔NaKC4H4O6·H2O〕，依次溶于500mL水中，在搅拌下参加300mL10％氢氧化钠溶液，用水稀释1000mL。通常可以参加1g碘化钾以防止铜离子自动复原形成一价氧化铜沉淀。124整理课件第二节

多肽因子类和蛋白质类药品检验所用的蒸馏水应在临用前煮沸以除去所溶解的二氧化碳，待冷却后配制。配好的双缩脲试剂应贮存于塑料瓶中〔或内壁涂以石蜡的玻璃瓶中〕。此试剂可长期保存，假设瓶中有黑色沉淀出现，那么应重配。125整理课件第二节

多肽因子类和蛋白质类药品检验B、标准曲线取6支试管，分别参加标准蛋白质溶液0、0.06、0.12、0.24、0.36、0.48、0.60mL，用水补足至0.60mL，然一每管各加双缩脲试剂2.4mL，混匀后在室温〔20～25℃〕保温15min，然后在540nm波长处进行比色测定。以溶液中蛋白质浓度为横坐标，以A540为纵坐标作标准曲线。5mg牛血清白蛋白/mL溶液A540约为0.27。该方法标准曲线的线性及重复性较好，一般要求每次测定样品都要作一次标准曲线以保持标准品和样品测定系统的一致性，消除操作误差。126整理课件第二节

多肽因子类和蛋白质类药品检验C、样品测定取样品0.6mL，同上法操作于540nm波长处测定吸收度，然后在标准曲线上查得样品的浓度，即得。注意样品浓度假设超过10mg/mL应做适当稀释。假设样品中脂类含量过高，那么在30min后会有雾状沉淀产生，故测定须控制在30min内完成。127整理课件第二节

多肽因子类和蛋白质类药品检验②微量双缩脲法

有些样品中蛋白质含量很少，在常量双缩脲法测定范围之外，可选用微量法进行测定。该法显色原理与双缩脲法相同，由于铜与蛋白质复合物的最大吸收峰260～280nm，但在此区域干扰因素及空白吸收都很大，而选在310～330nm测定干扰因素少一些，但仍比540nm测定灵敏10倍以上，因此可选用310nm进行比色测定，测定范围为0.1～1.0mg/mL；或用330nm测定，测定范围为0.2～2.0mg/mL。干扰此测定的物质包括组氨酸、丝氨酸、苏氨酸、Tris、乙醇胺、硫酸铵、尿素、去垢剂等。128整理课件第二节

多肽因子类和蛋白质类药品检验A、溶液的配制标准蛋白质溶液1.0或2.0mg/mL牛血清白蛋白溶液。微量双缩脲试剂称取173g枸橼酸三钠〔Na3C6H5O7·2H2O〕、100g无水碳酸钠一起溶于温水中，称取17.3g硫酸铜〔CuSO4·5H2O〕溶于100mL水中，两者合并用水稀释至1000mL。该试剂可长期保存，假设出现黑色沉淀需重配。129整理课件第二节

多肽因子类和蛋白质类药品检验B、标准曲线及样品测定取7支试管分别参加标准蛋白溶液0、0.15、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5mL，用水补足至1.5mL，加6％氢氧化钠溶液1.5mL混匀，再加0.15mL微量双缩脲试剂，混匀后在室温〔20～25℃〕保温15min，然后在310nm或330nm波长处进行比色测定，作标准曲线。1.0mg/mL的牛血清白蛋白溶液的A310约为1.04，A330约为0.67。C、样品测定取1.5mL样品同上操作，从标准曲线上查得其浓度。130整理课件第二节

多肽因子类和蛋白质类药品检验〔3〕福林酚试剂法蛋白质与福林酚试剂反响后形成的化合物可在750nm波长处测定吸收度，计算蛋白质的含量,测定范围为0.03～0.3mg/mL；或500nm波长处测定，范围为0.05～0.5mg/mL。该法标准曲线线性较差，样品浓度需按标准曲线校正。131整理课件第二节

多肽因子类和蛋白质类药品检验福林酚试剂的干扰因素包括Tris、HEPES、MOPS、MES、CAPSTES、CHES、枸橼酸、琥珀酸、谷氨酸、组氨酸、甘氨酸、N-二〔羟乙基〕甘氨酸、甘氨酰甘氨酸等缓冲液；EDTA、EGTA等鳌合剂；蔗糖、甘油、氨基葡萄糖、果糖、甘露糖、鼠李糖、木糖类山梨醇等糖类；酚、二巯基苏糖醇、巯基乙醇、谷胱甘肽、半胱氨酸等复原剂；汞、锰、钴等二价金属离子；Triton、Tween、Lubrol等去垢剂以及乙烯、乙二醇、聚乙烯、吡咯烷酮、载体两性电解质等。高浓度的尿素、盐酸胍、硫酸铵、硫酸钠、钾盐、三氯醋酸、乙醇、乙醚、丙酮、脂类等化合物也对测定有影响。132整理课件第二节

多肽因子类和蛋白质类药品检验A、溶液的配制

标准蛋白质溶液0.3或0.5mg/mL牛血清白蛋白溶液。福林试剂

试剂甲由下述三种溶液配制：称取20g无水碳酸钠、4g氢氧化钠溶解于1000mL水中；称取0.2g硫酸铜溶于20mL水中；称取0.4g酒石酸钾钠溶于20mL水中。测定前将三种溶液按100︰1︰1混合均匀，即得。混合30min后使用，混合液只能当天配制。三种溶液分开可长期保存。133整理课件第二节

多肽因子类和蛋白质类药品检验试剂乙〔福林试剂〕：试剂商店有售。配制：在2L的磨口回流装置内参加100g钨酸钠，25g钼酸钠，700mL蒸馏水。50mL85％磷酸及100mL浓盐酸充分混匀后，以小火回流10h，再参加150g硫酸锂，50mL蒸馏水及数滴液体溴，然后开口继续沸腾15min，以驱逐过量的溴，冷却后定容到1000mL，过滤，溶液呈黄绿色。以酚酞为指示剂，用标准氢氧化钠溶液滴定，使酸度为1mol/L即得。置于棕色瓶中冰箱保存。134整理课件第二节

多肽因子类和蛋白质类药品检验B、标准曲线在试管中分别参加标准蛋白质溶液0、0.025、0.05、0.075、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50mL，用水补足到0.50mL，加试剂甲2.5mL混匀后在室温〔20～25℃〕放置10min，再参加0.25mL试剂乙，立即混匀，室温放置30min，然后在500nm或750nm波长处测定吸收度。以标准蛋白质浓度为横坐标，吸收度为纵坐标作标准曲线。135整理课件第二节

多肽因子类和蛋白质类药品检验C、样品测定

把稀释至适宜浓度的样品按上述操作进行测定，测定吸收度通过标准曲线查得样品浓度。该法显色时间受温度影响较大，要注意控制在同一条件下进行。0.2mg/mL牛血清白蛋白溶液的A550约为0.33，A750约为0.56。136整理课件第二节

多肽因子类和蛋白质类药品检验〔4〕紫外吸收法①280nm光吸收法由于蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质在275～280nm波长处有一个紫外吸收顶峰，在一定范围内，蛋白质溶液在280nm波长处的光吸收度值〔A280〕与其浓度成正比，因此可作定量测定。该法测定范围为0.01～0.1mg/mL。该法简单、灵敏、快速、不消耗样品，低浓度的盐类不干扰测定，因此在蛋白质和酶的生化制备中广泛应用。137整理课件第二节

多肽因子类和蛋白质类药品检验由于不同蛋白质中酪氨酸和色氨酸的含量不同、所处的微环境也不同，因此不同蛋白质溶液在280nm的光吸收值也不同。据实验数据统计，浓度为1mg/mL的溶液的1800种蛋白质在280nm的光吸收值在0.3～3.0之间，平均值为1.25±0.51。138整理课件第二节

多肽因子类和蛋白质类药品检验测定方法：取3mL蛋白质溶液，以缓冲液作空白对照，用光径为1cm的石英比色杯，在280nm波长处测定吸收度值。通常以浓度为1mg/mL的蛋白质溶液的A280为1.0作为估算。假设该蛋白质的文献值，可直接计算出样品溶液中蛋白质的浓度。该方法适用于一般的半定量测定，也可用于纯蛋白质的定量测定。由于蛋白质的紫外吸收顶峰常因pH的改变而有变化，故用紫外吸收法时要注意溶液的pH值。139