牡丹珠心的非酶法分离技术研究

牡丹珠心的非酶法分离技术研究

0非离析分离法植物的胚胎和胚胎中的珠心、囊和囊细胞的体积非常小。根据是否使用离析处理，可分为三种类型：非离析分离法、离析分离法、非离析分离法和离析法。非离析分离法通常是利用解剖镜、镊子和解剖针等工具对胚珠内的微小结构进行显微解剖及分离,该方法用力不易控制,操作难度大,通常难以分离出具有原有形态的珠心等微小结构。离析分离法采用化学方法对组织和细胞进行离散处理,其中酶法分离是目前较常用的方法。利用酶法分离胚珠内的胚囊等微小结构,方法较成熟,但酶处理仅被用于破坏细胞的壁物质,使细胞间的坚固联系丧失,尚不能使珠被和珠心细胞自然离散,加之酶作用的条件苛刻,耗时长,这使得酶法分离胚囊等微小结构的操作仍具有一定的难度。非离析与离析结合分离法(如酶法与显微解剖、压片、渗透压冲击等方法结合使用),在分离胚珠内的微小结构时,具有操作相对简单、速度快、成本低等优势。牡丹(Paeoniasuffruticosa)是中国的国花,其育种学研究具有重要意义,但到目前为止有关其珠心、胚囊、卵细胞等的分离及后续的人工受精等研究未见报道。因此,对牡丹胚珠内的珠心进行分离具有一定的意义。笔者曾提出一种植物花形态观察新方法,并将其推广到显微操作领域。本研究利用该方法和笔者新近提出的整体透明技术,对牡丹的胚珠结构进行了观察和了解,并对牡丹的珠心进行了非酶法分离,所分离出的珠心等结构可进一步应用于胚囊和卵细胞的分离及组织培养研究。1材料和方法1.1试验时间和地点2009—2012年在河南科技大学农学院实验室内,对牡丹胚珠进行了珠心分离和结构观察试验。1.2牡丹花的结构观察2009—2010年在牡丹花期采集牡丹雌蕊,一部分直接用于牡丹胚珠的结构观察和珠心的分离,另一部分浸泡在50%～70%酒精溶液中,用于牡丹胚珠的结构观察。1.3测试方法1.3.1牡丹花珠心的分离将酒精溶液浸泡保存的牡丹胚珠用84消毒液原液(或稀释液)浸泡至透明,透明后经漂洗除去84消毒液等成分,然后制成水装片,或用爱氏苏木精染液染色,经水洗后制片。牡丹胚珠的切片采用徒手切片方法制取,切片经爱氏苏木精染色和漂洗后制片。牡丹胚珠的制片使用OlympusCX31荧光显微镜进行观察,观察时采用3种方法,即透射光观察、荧光观察、透射光与荧光同时观察。1.3.2牡丹珠心的分离取牡丹的1个心皮,用刀片纵向除去一部分子房壁,暴露出心皮内的胚珠,将其放在解剖镜下的胶块上,在解剖镜下用尖头镊子摘下1个胚珠,将胚珠粘在胶块上,并将牡丹心皮放入带盖容器内盖好,置于阴凉处或冰箱中备用。用镊子尖(或解剖针)将胚珠的外珠被纵向剖开,并向两侧掀开以暴露出内珠被,将内珠被的外层纵向轻轻地剖开、掀开,并除去一部分外珠被和内珠被外层,暴露出珠被绒毡层(内珠被的最内层)。按照同样的方法,将珠被绒毡层纵向剖开、掀开,并除去一部分外层结构,便暴露出牡丹的珠心,沿暴露面两侧将珠心外的结构逐步轻轻除去,最终可将牡丹的珠心分离出来。在分离珠心的过程中,按照上述方法,可分别获得除去外珠被的胚珠、除去外珠被和内珠被外层的珠心、除去内、外珠被的珠心3种微小结构。在分离珠心过程中,可使用凹玻片的凹槽或用镊子尖在胶块上挤压出1个小坑,向其中移入一些水液或染液,将分离出的珠心等结构转移到水液或染液中,在解剖镜下对其进行观察或制片。若需对珠心等进行染色,可在染色后吸出染液,换上水液漂洗数次,然后进行观察或制片。1.3.3观察结果的相位处理方法以及数码照片的生成观察结果利用数码相机进行拍照,数码照片仅使用word软件进行放大、缩小或剪切等处理,个别照片采用了光学信息解析方法进行处理。2结果与分析2.1牡丹花内珠被的荧光观察从花期牡丹雌蕊群(图版1-1)中摘下1个心皮,除去一部分子房壁暴露出胚珠(图版1-2)。将牡丹胚珠用84消毒液进行整体透明后,可观察到其2层珠被中外珠被很厚,内珠被较薄(图版1-3)。内珠被珠孔端的顶端不平整,由一些长、短间隔排列的裂片围成(图版1-4)。对经整体透明和除去外珠被的牡丹胚珠进行观察时,可见内珠被的外层颜色较浅,而最内层珠被绒毡层颜色较深(图版1-5)。在进行荧光观察时,珠被绒毡层能发出清晰的绿色荧光(图版1-6)。对牡丹胚珠的切片染色后进行观察,可见其外珠被很厚,而内珠被较薄,内、外珠被之间有1条平滑的分界线,这证实了外珠被易于剥离(图版1-7,1-8)。牡丹内珠被的厚薄不一,其最内层是细胞径向伸长的珠被绒毡层;珠被绒毡层的着色稍深,形成一些较圆滑的纵向皱褶,交替地突入到内珠被围成的珠被腔中,扩大了珠被绒毡层的表面积(图版1-8,1-9)。珠被绒毡层的照片经光学信息解析处理后,径向伸长结构更加明显(图版1-10)。对牡丹胚珠的切片进行荧光和透射光同时观察时,仅珠被绒毡层能发出清晰的绿色荧光,在切片上还发现内珠被外层与珠被绒毡层易于脱离,这证实了可通过显微解剖方法将内珠被外层除去(图版1-11)。将除去外珠被和内珠被外层的珠心进行荧光观察时,可观察到珠被绒毡层发出清晰的荧光(图版1-12)。除去内珠被外层后,在珠被绒毡层的剥离面上,可观察到珠被绒毡层的纵向垂周壁上有浅波状皱褶(图版1-13)。2.2牡丹花珠心剖相将新鲜的牡丹胚珠粘在解剖镜下的胶块上(图版1-14),将外珠被纵向剖开、掀开,暴露出内珠被(图版1-15,用染液对其染色)。除去外珠被的胚珠呈长卵形,珠孔端较细(图版1-16,1-17)。对其进行染色、制片,可见其具有2层结构,外层为内珠被外层,内层为珠被绒毡层及珠心(图版1-18)。将外珠被和内珠被外层除去后,可获得外层为珠被绒毡层的牡丹珠心,将其悬浮在水液中,在解剖镜下观察呈椭球状,其表面不光滑,珠孔端有1个较宽阔的开口(图版1-19)。将此珠心制成水装片后,由于无法悬浮、受自身重力和挤压作用,便失去原有形态,成扁平状,在其2层结构中,外层色深,为珠被绒毡层,内层为珠心(图版1-20)。当纵向依次剖开、掀开并除去一部分外珠被、内珠被外层和珠被绒毡层后,便暴露出珠被腔中的珠心(图版1-21)。将分离出来的珠心移入水液中,可见其呈椭球状,表面光滑(图版1-22)。制片时,由于失去浮力、受自身重力和挤压作用,珠心失去原有形态,成扁平状(图版1-23)。3牡丹花珠心的分离牡丹胚珠具有2层珠被,其外珠被很厚,容易除去,而内珠被的外层容易与珠被绒毡层脱离并除去,但除去珠被绒毡层的难度稍大。在牡丹的胚珠中,只有珠被绒毡层能够发出清晰的荧光。在解剖镜下,利用胶块依次将牡丹胚珠的外珠被、内珠被外层和珠被绒毡层除去后,可分离出具有原有形态的牡丹珠心。在非酶法分离牡丹珠心时,分别要除去外珠被、内珠被外层、珠被绒毡层3层结构,其剥离的难度依次增加。在牡丹胚珠中,只有珠被绒毡层能够发出清晰的荧光,在进行珠心分离时可依此检测分