98c-mdp治疗大鼠佐剂型关节炎的疗效及对血清nf和il-1的影响

98c-mdp治疗大鼠佐剂型关节炎的疗效及对血清nf和il-1的影响

0新的ra临床研究目前，还没有药物可以完全治愈类风湿性关节炎（ra）。类固醇抗炎药常用于临床应用，如缓慢抗风湿药和肾上腺皮质激素，副作用严重，只能减缓疾病的发展。中国核动力研究设计院成都同位素应用研究所于1998年研制出新药99Tc-MDP(technetium-99conjugatedwithmethylenediphosphonate),通用名锝[99Tc]亚甲基二膦酸盐注射液(云克),试图改变RA的病理进程。2000年起99Tc-MDP被陆续应用于临床,而对其疗效的相关动物实验研究报道不多,且用关节核素显像感兴趣区放射性比来评价其在RA治疗中作用的动物实验研究目前尚未见报道。本实验通过对99Tc-MDP治疗大鼠佐剂型关节炎的研究,分析其疗效,现报道如下。1材料和方法1.1动物饲料的制备清洁级SD雌性大鼠,6～8周龄,体质量(180.20±2.68)g,购于上海斯莱克实验动物有限责任公司[生产许可证号:SCXK(沪2003-0003)],饲以全价颗粒饲料。1.2tc-mdp注射液的制备完全弗氏佐剂:10ml/支,美国Sigma公司产品(批号:054K8931);99Tc-MDP注射液[成都云克药业有限责任公司提供(国药准字:H20000218)]。规格为A剂每瓶5ml,内含锝[99Tc]0.05μg,B剂每瓶内含亚甲基二磷酸5mg、氯化亚锡0.5mg。使用前,在无菌操作条件下,将A剂5ml注入到B剂瓶中,充分振摇,使冻干物溶解,室温静置5min,即制得99Tc-MDP注射液。肿瘤坏死因子(tumournecrosisfactor,TNF)和白细胞介素-1β(IL-1β)放免药盒购于解放军总医院科技开发中心放免所(批号:20060825)。1.3方法1.3.1左足皮内注射取清洁级雌性SD大鼠30只,随机分为对照组、佐剂型关节炎组和99Tc-MDP治疗组,每组10只。除对照组外,其余两组大鼠均在左足跖皮内注射完全弗氏佐剂0.1ml免疫造模后第10d起(以注射当天算起),治疗组给予99Tc-MDP注射液(2.5×10-3μg/kg,以99Tc含量计算)腹腔内注射,每2d重复注射1次,对照组和佐剂型关节炎组分别给子等量的等渗盐水腹腔内注射。1.3.2踝间宽度和自动预防期试验每2周观察1次各组大鼠左踝关节左右径宽度、关节炎指数变化。大鼠左踝关节左右径宽度用游标卡尺(精确度0.02mm)测量左后肢内外踝间宽度。关节炎指数评定采用关节炎评分法(0～4级)。0分:无关节炎;1分:关节有红色斑点或轻度肿胀;2分:关节中度红肿;3分:关节重度红肿;4分:关节严重红肿且不能负重。1.3.3放射性计数比检测治疗后的第2、4、6周所有大鼠尾静脉注射99Tcm-MDP(由南京森科医药技术有限公司标记,放化纯度97%)0.2ml(3mCi),30min后在美国通用公司生产的MillenniumVG双探头符合线路SPECT仪上用低能高分辨针孔准直器采集图像,显像条件为能峰140KeV,矩阵512×512,能窗20%,采集6min/帧,用感兴趣区分析法计算大鼠左踝关节区和右胫腓骨的放射性计数比。1.3.4血清il-1、tnf、il-1、tnf、il-1对于治疗后的第4和6周所有大鼠经眼眶静脉丛取血1ml,离心后冻存血清,采用TNF和IL-1β放免药盒,在GC-1200放射免疫计数器上进行检测。1.3.5左术后踝关节的固定于治疗后的第4周每组各处死2只大鼠,第6周处死所有大鼠。取左后肢踝关节,于4%甲醛溶液中固定。24h后取关节囊常规苏木精-伊红染色,光镜下观察组织形态变化,大部标本用5%稀硝酸脱钙,常规石蜡包埋,切片(4μm)。1.4多组均数展望用SPSS11.0统计软件进行统计分析。定量数据以均数±标准差(ˉx±s)(x¯±s)表示,多组均数间两两比较用单因素方差分析LSD检验。两独立组均数间比较用两样本均数比较的t检验。P≤0.05为差异有显著性统计学意义。2结果2.1大鼠左踝关节水肿比较造模24d后,大鼠佐剂型关节炎模型已形成,佐剂型关节炎组大鼠左踝关节肿胀明显,与对照组比差异显著(P<0.01);治疗组在治疗后2周,左踝关节肿胀程度较佐剂型关节炎组稍轻(P<0.05),而治疗后4和6周则明显减轻(P<0.01)。见表1。2.2两组大鼠的另外一个决策权治疗后2周起,治疗组大鼠关节炎指数较佐剂型关节炎组低,差异有显著性统计学意义。见表2。2.39放射性比较造模24d后,大鼠佐剂型关节炎模型已形成,佐剂型关节炎组大鼠感兴趣区放射性比较正常对照组大(P<0.01);治疗组在治疗后的第4周较同期佐剂型关节炎组小(P<0.05),而在治疗后的第2周和第6周与同期佐剂型关节炎组比较虽小,但差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。2.4两组nf和il-1水平比较治疗后4周和6周,佐剂型关节炎组大鼠血清TNF和IL-1β水平较正常对照组明显升高;治疗组血清TNF和IL-1β水平较同期佐剂型关节炎组低,差异有显著性统计学意义。见表4。2.5治疗组和佐合适组治疗前后滑膜组织病变情况比较佐剂型关节炎组和治疗组大鼠的左踝关节病理检查均提示有滑膜增生和炎性细胞浸润,但治疗组较佐剂型关节炎组要轻。在治疗后第4周时,治疗组和佐剂型关节炎组滑膜组织增生和炎性细胞浸润均较明显,滑膜组织细胞层次不清;第6周时治疗组与正常对照组比较仍有滑膜组织增生和炎症细胞浸润,但滑膜组织细胞层次清楚,与佐剂型关节炎组比较滑膜组织增生程度稍轻,而炎性细胞浸润程度则明显减轻(图1,见后插页)。3大鼠佐类药物综合征类目前利用见表1RA是滑膜关节的一种复杂的炎性病变,以手足的小关节受累为主,表现为关节破坏、变形,逐渐失去功能。全世界RA的患病率约为1%,是社会经济的一个严重负担,不仅是因为庞大的医疗费用,而且还包括因患者丧失工作能力和降低生活质量带来的间接损失。由于其发病机制尚未完全明确,因而临床上缺乏一种特异性的治疗方法,治疗的目的是延缓病程,控制和预防因关节破坏而导致的关节功能丧失,减轻症状,提高生活质量。目前,治疗RA的药物有类固醇类抗炎药、慢作用抗风湿药和肾上腺皮质激素等,但这些药物都不能完全阻断或逆转其病理过程,因此,临床上急需一种能逆转RA病理进程并且安全有效的药物投入使用。99Tcm-MDP由于其对骨关节部位有良好的靶向性,并且发射出γ射线可供监测而被广泛应用于骨关节显像。99Tcm-MDP对骨关节部位同样具有良好的靶向性,其中的微量元素锝半衰期长达1年以上,可被认为无放射性,通过低价锝(+4价)得失电子,不断清除人体内的自由基,防止免疫复合物的形成,保护超氧化物歧化酶的活力,从而调节人体免疫功能;而亚甲基二膦酸盐能抑制前列腺素的产生,并通过螯合金属离子而降低若干基质金属蛋白酶(包括胶原酶)的活性,具有消炎镇痛并防止胶原酶对软骨组织的分解破坏作用。其在临床上的应用已有多家报道,但对其疗效的动物实验研究尚不多。佐剂型关节炎是细菌学家Freund于20世纪50年代创立,又称福氏佐剂关节炎,是免疫性关节炎动物模型的基本方法。大鼠佐剂型关节炎与人类的RA有许多相似之处,如关节肿胀、软骨退变、关节功能丧失等,佐剂型关节炎最重要的一个特征是慢性滑膜炎,包括炎细胞浸润、血管翳形成、软骨组织的破坏和骨侵蚀。因此,大鼠的佐剂型关节炎模型被多位学者用于对RA的研究。99Tc-MDP注射液在临床上应用时为1次/d,20d为1个疗程,根据病情可适当增加剂量、延长疗程,且随着剂量增加、疗程延长,其疗效更好,但不良反应也有增加趋势。由于99Tc-MDP注射后聚集在骨的生成区和骨关节部位,体内的半衰期达1～10年,长期发挥疗效,无须血药浓度的维持。本实验采用隔天腹腔注射给药,试图减少其可能的不良反应,并观察其疗效。在整个实验过程中无一只大鼠死亡,用药后2周时(注射7次),治疗组大鼠左踝关节左右径宽度即比佐剂型关节炎组减小,但差异无统计学意义(P>0.05),而在治疗后的第4和6周治疗组大鼠左踝关节左右径宽度较佐剂型关节炎组的明显减小(P<0.01);99Tc-MDP腹腔注射后2周起,治疗组大鼠关节炎指数较佐剂型关节炎组低。以上两个指标的比较说明99Tc-MDP在减轻佐剂型关节炎大鼠关节红肿方面的疗效肯定。99Tcm-MDP用于关节显像的机制与滑膜炎继发新生血管形成、血流增加、血管通透性增高、炎性反应,导致关节周围骨更新旺盛有关,99Tcm-MDP显像感兴趣区分析法是判断RA关节病变及其活动性的一种比较好的半定量分析方法。99Tc-MDP具有抗炎作用,故在第4周时治疗组T/NT值较佐剂型关节炎对照组小(P<0.05),第6周时两组间的差异已无统计学意义,这可能与大鼠佐剂型关节炎模型病程的自限性影响有关。TNF、IL-1β作为炎性指标,其水平与RA病情相关,其作用机制为①刺激滑膜纤维母细胞产生胶原酶及前列腺素E2等炎性介质。②激活血管内皮细胞,促进白细胞与血管内皮粘附渗透导致局部炎症。③抑制糖蛋白合成,增加糖蛋白分解,并产生中性蛋白酶,释放骨钙,从而导致骨和软骨的破坏。在体外,TNF、IL-1β能诱导RA患者滑膜细胞丝裂原活化蛋白激酶的显著激活,作为细胞内信号转导的重要分子,丝裂原活化蛋白激酶激活后进一步上调TNF、IL-1β等炎性因子的水平,形成正反馈,使RA患者局部和全身炎症持续存在。因此,在RA的治疗中,有效降低TNF和IL-1β的水平能对RA的疗效及预后起积极作用。本实验中治疗后第4和6周治疗组大鼠的TNF、IL-1β水平较佐剂型关节炎对照组明显减低(P<0.05),说明99Tc-MDP对该病治疗的有效性,这也从治疗后佐剂型关节炎大鼠关节肿胀的改善所证实。罗卉等通过对云克治疗胶原诱导性关节炎大鼠的实验研究中发现云克能明显降低血清IL-1β水平,罗永忠等在临床观察中也证实云克能有效降低RA患者的TNF、IL-1β