诊断学-临床常见病原体检测

实验诊断（LaboratoryDiagnosis）临床常见病原体检测感染性疾病的现状感染性疾病的病原体：细菌、病毒、真菌、支原体、衣原体、立克次体以及寄生虫等。自从抗生素的发现和预防接种的实施，许多曾严重危害人体健康的病原体已消灭或基本消灭新的传染病陆续被发现，曾绝迹的老传染病部分死灰复燃。条件致病菌感染比例增加。多重耐药菌株不断出现，真菌感染的几率逐年增高。------临床病原体检查的重要性提纲第一节：标本的采集运送，实验室评价和检查方法第二节：病原体耐药性检测

药敏检测第三节：临床感染常见病原体检测第四节：病毒性肝炎检测第五节：性传播疾病病原体检测

病原体检测

第六节：医院感染常见病原体检测

临床病原体检查目的确定感染的发生和性质早期诊断选择治疗方案预防措施防止广泛传播第一节

标本采集、运送和检查方法一.标本采集和运送基本原则1：选择标本的种类和采集部位并要反映有效病程2：采集和运送应无菌操作，防止污染3：尽快送检4：要视所有标本为传染品

明显标识

特别标注5：标本用后要消毒处理（一）血液适应症：疑为菌血症、败血症和脓毒血症患者。采血时间：一般在发热初期、发热前2小时或发热高峰期采集，已用过抗菌药物治疗者，在下次用药前采集。24小时内采血标本3次，并在不同部位采集，可提高血培养阳性检出率。采血量：成人10~20ml/次，婴儿和儿童1~5ml。(二)尿

液无菌采集中段尿10~20ml于灭菌容器内厌氧菌的培养，膀胱穿刺法排尿困难者可导尿，插入导尿后

留弃15ml后再留取标本

★尿液中注意不要加防腐剂（三）粪

便取含脓、血或粘液粪便置于清洁容器内排便困难者或婴幼儿可用直肠拭子怀疑霍乱引起腹泻的粪便应置于碱性蛋白胨水或卡-布运送培养液送检传染性腹泻患者需

3

次送检病原学明确诊断后，不同时间至少3次培养阴性出院（四）呼吸道标本采集时间：晨痰，且在取痰前用清水反复漱口方法（1）自然咳痰法；（2）气管镜下采集法；

（3）气管穿刺法。符合要求痰标本：存在正常菌群，注意鉴别≤10鳞状上皮/LPH及≥25个WBC/LPH（四）呼吸道标本注意事项痰标本采集后应及时送检和处理，最好不超过1小时，室温下延搁数小时，定植于口咽部的非致病菌呈过度生长，导致检出率明显下降。另外上呼吸道存在正常菌群，在采集标本与结果分析时应予考虑。（五）脑脊液与其他无菌体液脑膜炎病原体：脑膜炎奈瑟菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌等，抵抗力弱、不耐冷、易死亡，脑脊液标本应立即保温送检或床边接种胸腹水等体液标本应接种于血培养瓶中感染患者腹膜透析液标本，至少需采集50ml。（六）生殖道标本性传播疾病取尿道口分泌物、阴道宫颈口分泌物、前列腺液生殖道疱疹常穿刺取疱疹液，盆腔脓肿于直肠子宫凹陷处穿刺取脓淋病奈瑟菌保温送检，其余标本收集后4°C保存至培养，超过24h，应冻存于-70°C（七）创伤、组织和脓肿标本损伤范围大的创伤：不同部位多份标本，采集部位先清污、消毒，防止表面污染菌混入标本较小：加无菌等渗盐水开放性脓肿的采集：无菌棉拭子采脓液及病灶深部分泌物封闭性脓肿：穿刺抽取。疑为厌氧菌感染，应隔绝空气采集标本的实验室质量评估标准患者信息标本采集时间及送检时间送检容器完整性、是否污染贮存及运送方式不当个人防护检查方法直接显微镜检测病原体特异性抗原检测病原体核酸检测（PCRDNA探针）

初步诊断血清学实验（查特异性抗体/抗原）病原体分离培养和鉴定

确定诊断

DiagnosisStrategyforBacterialInfection可疑细菌感染血清学诊断（双份血清）特异性抗体检测试管凝集沉淀反应补体结合试验采集标本细菌成分检测抗原检测核酸检测凝集试验协同凝集试验乳胶凝集试验ELISA免疫荧光检测核酸杂交聚合酶链反应直接形态学检查细菌分离培养鉴定形态检查生化反应抗原检测动物试验（毒力）药敏试验直接显微镜检测-涂片不染色标本涂片不染色：适用于检查生活状态下病原体的生长、

动力及运动方式、螺旋体的形态和运动方法：悬滴法、压滴法或湿式涂片

置于暗视野或相差显微镜下观察

直接显微镜检测-涂片染色标本染色标本：光学显微镜下观察细菌的形态。染色性或观察宿主细胞内包涵体的特征。方法：革兰染色、抗酸染色、墨汁染色直接显微镜检测-染色标本革兰染色结果直接显微镜检测-染色标本墨汁染色找新生隐球菌抗酸染色直接显微镜检测——荧光显微镜检查荧光显微镜用于标本经荧光染色后直接检出某些病原微生物直接显微镜检测——免疫电镜检查SARS（severeacuterespiratorysyndrome)病原体的确定电镜检查不常规用于临床，对某些病毒感染却有确诊的价值直接显微镜检测——免疫电镜检查电子显微镜下发现为某种冠状病毒直接显微镜检测的意义无菌体液的直接镜检对病原体诊断具有一定意义对正常菌群寄居腔道的分泌物涂片镜检可提示进一步检查的步骤、采取的方法和分离鉴定病原体所需培养基由于临床标本中常含有一定浓度的抗菌物质，以致分离培养可为阴性，此时的镜检所见往往可能在诊断上起重要作用荧光显微镜检查用于标本经荧光染色后直接检出某些病原微生物电镜检查虽不常规应用于临床，但对某些病毒感染却有确诊的价值病原体分离培养和鉴定意义：分离培养是微生物学检验中确诊的关键步骤。明确感染病原体；为临床提供体外抗微生物药物敏感试验结果。培养基的选择分离培养和鉴定病原体检测方法病原学初步诊断（临床症状、体征、镜下检查）选择最合适的培养方法（适当的培养基、接种前的标本处理、确定孵育条件）分离菌的鉴定（菌落性状和细菌的形态、染色性，细菌生化反应结果，血清学实验等）鉴定细菌的同时，需作抗生素的药敏试验

第二节

病原体耐药性检测病原体耐药性检测抗生素压力（一）抗微生物药物敏感性试验（AST）抗微生物药物敏感性试验（antimicrobialsusceptibility,AST)对敏感性不能预测的临床分离菌株进行药敏试验，以指导临床选择治疗药物和了解区域或医院内常见病原菌耐药性变迁，有助于临床经验性治疗选药。常用抗菌药物敏感试验的方法常用敏感性试验的方法K-B纸片琼脂扩散法（Kirby-Bauerdiscagardiffusionmethod)稀释法（dilutiontest）E试验（Etest）耐药筛选试验折点敏感试验K-B纸片琼脂扩散法K-B纸片琼脂扩散法按敏感（Susceptible，S）、中度敏感（Intermediate，I）、耐药（Resistant，R）报告。S：测试菌能被测定药物常规剂量给药后在体内达到的血药浓度所抑制或杀灭。I：

测试菌能被测定药物大剂量给药后在体内达到的血药浓度所抑制，或在测定药物浓集部位的体液（如尿）中被抑制。R：测试菌不能被在体内感染部位可能达到的抗菌药物浓度所抑制。稀释法Minimalinhibitoryconcentration（MIC）最小抑菌浓度：某些抗菌药物抑制检测菌肉眼可见生长的最低浓度称为最小抑菌浓度EtestEtest应用抗菌药物塑料试条结合稀释法和扩散法操作简单、价格昂贵（二）耐药菌监测试验由于细菌存在一种或几种耐药机制，造成了细菌的多重耐药性。单一的药敏试验已不能完全表示细菌的耐药性，必须进行一些特殊的耐药性监测试验。1.耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）的筛选测定2.氨基糖苷类抗生素高耐药肠球菌的筛选测定3.耐青霉素肺炎链球菌（PRSP）的筛选测定4.-内酰胺酶检测5.超广谱-内酰胺酶（ESBL）检测第三节临床感染常见病原体检测

临床常见病原体为：细菌、病毒、真菌、寄生虫、支原体、衣原体以及立克次体等。检查项目和临床应用——细菌感染细菌感染性疾病一般均需进行细菌学诊断以明确病因检查方法：1、检测细菌或抗原（直接涂片显微镜检查、培养、抗原检测与分析）2、检测抗体3、核酸检测（基因探针技术、PCR技术）

★

上述多种检查手段中，细菌培养是最重要的确诊方法检查项目和临床应用——病毒感染病毒是只能在易感细胞内以复制方式进行增殖的非细胞型微生物检查方法：分离培养与鉴定、核酸或抗原的检出及抗体的检测

★细胞培养是最重要的分离方法检查项目和临床应用——真菌感染真菌是以腐生或寄生方式摄取养料的真核细胞型微生物真菌的微生物学诊断手段：直接检查、培养检查、免疫学试验和动物试验检查项目和临床应用——真菌感染真菌抗原检测只使用于血清或脑脊液中隐球菌、念珠菌以及荚膜组织包浆菌等真菌血清学试验：深部真菌感染检查项目和临床应用——寄生虫病直接显微镜检查：观察寄生虫生活史的各阶段，是寄生虫感染的主要诊断依据寄生虫免疫学方法：辅助诊断检查项目和临床应用——其他病原体感染支原体：分离培养是确诊依据。螺旋体：（除钩端螺旋体外，均不能培养）检测血清中的特异性抗体。立克次体：外裴氏试验，血清采取发病1周、2周及4~6周。衣原体：检查胞质内的包涵体。SARS：免疫学方法、基因检测及细胞培养（是鉴别SARS感染最为准确的方法）第四节

病毒性肝炎检测病原学及肝炎的命名HAV(RNA)甲型肝炎HBV(DNA)乙型肝炎HCV(RNA)丙型肝炎HDV(RNA)丁型肝炎HEV(RNA)戊型肝炎HGV(RNA)庚型肝炎TTV(DNA)输血传播病毒肝炎病毒性肝炎类型ABCDE传染源粪便血液/血液/血液/粪便血源性物质/血源性物质/血源性物质/

体液体液

体液传播途径粪-口经皮肤/粘膜经皮肤/粘膜

经皮肤/粘膜

粪-口慢性感染否是是是否基因组类型ssRNAdsDNAssRNAssRNAssRNA

一.甲型肝炎病毒（HAV)

甲型肝炎病毒（HepatitisAvirus,HAV)属微小的RNA病毒科，无包膜，核心为单股正链RNAHAV主要通过粪口途径传播病毒标志：HAVAg、抗HAV、HAV-RNA一.甲型肝炎病毒（HAV)临床表现为急性黄疸肝炎二.乙型肝炎病毒（HBV)二.乙型肝炎病毒（HBV)HBV为乙型病毒性肝炎的病原体，血液为其主要的传播途径机体感染HBV后产生相应的免疫反应，形成多种不同的抗原抗体系统表面抗原抗体系统（HBsAg，抗HBs）核心抗原抗体系统（HBcAg,抗HBc）e抗原抗体系统（HBeAg,抗HBe）（1）HBsAgHBsAg是HBV的外壳，不含DNA，故HBsAg本身不具传染性；但因其常与HBV同时存在，常被用来作为传染性标志之一。HBsAg（+）表示：肝中有HBV

见于乙型肝炎潜伏期和急性期

慢性迁延性肝炎，慢性活动性肝炎，肝硬化，

肝癌，慢性HBsAg携带者。（2）抗-HBs抗-HBs是种保护性抗体，可阻止HBV穿过细胞膜进入新的肝细胞，阳性提示机体对乙肝病毒有一定程度的免疫力抗-HBs（+）表示：①既往曾感染过HBV，现已恢复；②接种乙肝疫苗后；③被动性获得抗-HBs抗体（3）HBeAgHBeAg（+）表示：患有乙型肝炎，是病毒复制活跃，传染性强的指标。HBeAg持续阳性的乙型肝炎，表示肝细胞损害较重，且可转为慢性乙型肝炎或肝硬化。HBeAg（+），HBsAg（+）的孕妇可引起垂直传播。（4）抗-HBe抗-HBe（+）意味着大部分HBV被清除，复制减少，传染性减低，但并非无传染性。乙肝急性期即出现抗-HBe阳性，易发展为慢性乙型肝炎。

慢性活动性肝炎出现抗-HBe阳性，可发展为肝硬化。e抗原与e抗体均阳性，且ALT升高可进展为原发性肝癌。（5）抗-HBc可分为IgM、IgG、IgA三型，目前常用的方法是检测抗-HBc总抗体，抗-HBc总抗体主要反映的是抗-HBcIgG。抗-HBc检出率比HBsAg更敏感，可作为HBsAg阴性的HBV感染的敏感指标。抗-HBc检测也可用作乙型肝炎疫苗和血液制品的安全性鉴定和献血员的筛选。临床意义HBsAg——感染的标志Anti-HBs——既往感染/接种疫苗Anti-HBcIgM——急性感染标志Anti-HBcIgG——既往或慢性感染HBeAg——急性病毒复制，有传染性Anti-HBe——病毒不再复制HBV-DNA——急性病毒复制，比HBeAg更准确，主要用于监测治疗反应血清学检测的临床意义HBsAg

抗-HBsAgHBeAg抗-Hbe抗-HBc临床意义+-+-+急性或慢性感染（大三阳）+--++乙肝后期或慢性感染（小三阳）+-+--潜伏期或急性乙肝早期-+-++痊愈或恢复期，有免疫力-+--+痊愈，有免疫力-+---疫苗接种或曾经感染过，有免疫力乙型肝炎病毒表面抗原蛋白

前S1、前S2和前S1抗体、前S2抗体测定Pre-S抗原位于HBV的外衣壳上，有两种刺激集体产生抗Pre-S1和抗Pre-S2，能阻断HBV与肝细胞受体结合，从而起到抵抗病毒的作用抗Pre-S1和抗Pre-S2的出现，表示病情好转，趋向痊愈三.丙型肝炎病毒（HCV)HCV为黄病毒属、单链正股RNA病毒，由核心和包膜组成。血液为其传播途径病情虽较乙型肝炎轻，但更易转为慢性抗-HCVIgM阳性

常见于急性HCV感染，是诊断丙肝的早期敏感指标；是HCV活动的指标，是判断HCV传染性的指标。

抗-HCVIgG阳性

表明体内已有HCV感染，但不能作为感染的早期指标第五节性传播疾病病原体检测性传播疾病病原体检测性传播疾病（sexuallytransmitteddisease,STD)简称性病，是一类能通过各种性接触而传播的侵犯皮肤、性器官及全身脏器损害的疾病。常见临床类型

性病

病原体艾滋病

人类免疫缺陷病毒梅毒

梅毒螺旋体淋病

淋球菌非淋球菌尿道炎

沙眼衣原体、解脲支原体生殖器疱疹

单纯疱疹病毒尖锐湿疣

人乳头瘤病毒软下疳

杜克雷嗜血杆菌重要的性病及诊断金标准

性病

诊断金标准

淋病

分离培养

梅毒

特异性抗体检测

艾滋病

免疫印迹法与RT-PCR非淋球菌尿道炎

分离培养、鉴定生殖器疱疹

分离培养、鉴定

尖锐湿疣PCR