赤潮甲藻毒素结构转换性研究

赤潮甲藻毒素结构转换性研究

在过去10年中，高等植物、动物、微生物和微生物的二级代谢产物的传统来源已成为自然产物研究的主要目标。微甲藻是海洋中有机物质和生物量的主要生产者。许多甲藻的降解产物具有独特的结构和完全不同于陆生植物降解产物的特殊的生物合成途径。一系列具有独特的化学结构和生物学活性的化合物在海洋生物尤其在海洋无脊椎动物中被发现。麻痹性贝毒(paralyticshellfishpoisoning,PSP)是由能形成有毒赤潮的甲藻Alexandriumtamarense,A.cateneella,A.acatenella,A.cohorticula,A.fundyense,A.fraterculus,A.nimutum,Gonyaulaxtamarensis,Gymnodiniumcatenatum,Pyrodiniumbabamensevarcompressum等以及一种淡水蓝绿藻Aphanizomenonflos-aquae产生的一类有毒生物活性物质,是目前分布最广危害最大的一种赤潮藻毒素。经由食物链的传递,人食用染毒的贝类后,中毒症状表现为面部、肢端麻木,严重的会因呼吸肌麻痹而导致死亡。我国也曾发生多起麻痹性贝毒中毒事件。麻痹性贝毒是通过选择性阻断电压门控Na+通道,导致动作电位无法形成而中毒。目前对于藻毒素的商业需求日益增加。在环境方面,大规模赤潮毒素的监测、治理工作的开展,急需各种不同规格的藻毒素标准品,尤其是麻痹性贝毒标准品。在医学方面,由于麻痹性贝毒对Na+通道的特异性结合,已成为分子生物学研究的重要工具,被用来测定Na+通道的数目和亲和力;开始探索麻痹性贝毒毒素镇痛、麻醉、解痉及止喘的治疗作用,也有用作抗癌药方面的探索研究,STX(PSP的一种)对癌细胞的破坏性相当高,癌细胞对STX比一般细胞的抵抗性小;麻痹性贝毒还具有重要的潜在军事意义。因此,研究麻痹性贝毒的生物合成途径,制备麻痹性贝毒标准品,对满足各个行业对麻痹性贝毒的需要,具有重要的指导意义和商业价值。同时对于揭示麻痹性贝毒在有毒赤潮形成中的生理学作用,为有毒赤潮的预报和防治提供理论基础。本文就麻痹性贝毒的生物合成途径方面的研究成果做一综述。1gocyautoxin及nanos-aquae的合成赤潮甲藻毒素麻痹性贝毒PSP是一类含有三个环的四氢嘌呤类化合物,目前已经发现近20种异构体。从结构上这类化合物可被分为两大类:石房蛤毒素(saxitoxin)和新石房蛤毒素(neosaxitoxin)。也可以被进一步分为四类,分别是氨基甲酸酯类毒素;N-磺酰氨甲酰基类毒素;脱氨甲酰基类毒素;脱氧脱氨甲酰基类毒素。关于这些化合物的结构和化学性质已经被Shimizu等为代表的学者进行了研究和报道。关于这类独特的三环富氮天然生物活性物质的生物合成途径的了解十分有限。事实上,像嘌呤核苷酸、C7糖或精氨酸曾被认为是这类化合物生物合成中可能的前体化合物,但这类光合成产毒甲藻的非异养生物本性完全否定了这些通过甲藻的喂养实验而得出的推测,因为它不能利用外源的有机化合物。后来,Shimizu等使用标记的前体化合物对这些有毒化合物的生物合成途径进行了深入的研究。Shimizu等首次从gonyautoxin-Ⅱ检测到毒素的羰基和两个胍基是从精氨酸的胍基衍生而来。经过许多次使用各种氨基酸和可能的前体化合物供给培养的产毒甲藻的实验失败后,Y.Shimizu决定使用更小更简单的分子进行喂养实验,因为小分子更容易渗入到系统中。在早期的实验中,使用[2-13C]标记的甘氨酸喂养Gonyaulaxtamarensis,发现在分离的毒素gonyautoxin-Ⅱ中所有的C都具有同位素丰度,但C-11和C-12具有特别高的同位素丰富度。为了解释这一结果,Y.Shimizu假设甘氨酸是经由glyoxalate-TCA循环途径被吸收合并进α-酮戊二酸盐结构的。因为α-酮戊二酸盐是精氨酸及其相关化合物的前体,这个结果当时被认为支持了Chevolot等提出的毒素的精氨酸前体理论。随后使用特殊标记的前体化合物进行实验,得出的结果解释了两个相邻碳的不同寻常的同位素丰富度。Y.Shimizu使用[1,2-13C]标记的乙酸供给实验室培养的C.tamarensis之后,分析发现在gonyautoxin-Ⅱ和neosaxitoxin的所有C都具有同位素丰度,但在C-5和C-6上观察到额外高的碳同位素丰富度。这两个相邻碳的高同位素丰度,表明C-5和C-6来自同一个乙酸单元。而该种偶联途径否定了精氨酸前体理论,按照精氨酸前体理论C-5必需来自精氨酸的C-1。IkawaM.用一种产生saxitoxin和neosaxitoxin毒素的蓝-绿甲藻Aphanizomenonflos-aquae的进一步研究得出相同的实验结果。因此确定在分离的neosaxitoxin中[1,2-13C]乙酸单元被合并在C-5和C-6位置,此外还能观察到另一个乙酸单元在C-10和C-11的合并,但比例却少得多。为了决定合并的乙酸单元的来源,Y.Shimizu使用[2-13C]单独标记的乙酸完成喂养实验,结果却完全出乎意料,在C-6和C-11上发现了同位素丰度。为了解释这些看似矛盾的实验结果,Y.Shimizu提出了一个新的合成通道。关键步骤是一个乙酸单元或者它的衍生物与精氨酸或其等价物在α碳上的胺基的CLAISEN聚合(克莱森聚合),随后脱去羰基碳,在相邻的羰基碳上形成咪唑环。在这样的合成过程中精氨酸或它的前体的C-2和α-胺基仍然被完整的合并进毒素的分子中。Gupta等用(2-13C)和(1,2-13C2)标记的乙酸喂养实验表明C-5和C-6来自同一个乙酸单元,而毒素环结构上的其余部分由精氨酸衍生而来。Y.Shimizu用(2-13C、2-15N)标记的精氨酸喂养生物,发现13C-15N被完整的结合在产物中。随后按照Martinkus的方法从二乙基[2-13C]标记的丙二酸和[15N]标记的邻苯二甲酰亚胺钾制得[2-13C2-15N]双标记的鸟氨酸,它是精氨酸直接生物合成前体,进行产毒藻Aphanizomenonflos-aquae的喂养实验,分离毒素Neosaxitoxin,做13CNMR测定。在C-4上观察到显著的同位素丰度,由于和邻近氮的旋转偶联,该信号清晰的表现为成对物(J=9.1Hz)。该结果结合先前的[1-13C]精氨酸和[1-13C]鸟氨酸喂养实验并不导致特别的同位素丰度的结果,为新提出的合成途径提供了强有利的支持。Gupta通过使用(2-13C-2-H3)标记的乙酸喂养实验,发现C-6上的H并不是来自乙酰基,在甲基化的过程中,乙酸甲基上的一个氢重排到C-5上。通过用(甲基-13C、2H3)标记的蛋氨酸喂养实验,证实蛋氨酸甲基上的氢只有一个被留在副链的甲烯基上。基于这样的实验结果,认为副链碳是由双键上的亲电子轰击而插入,随后一个H+迁移并失去一个质子。末端的甲烯基转化为甲醇可能是通过环氧化物形成,再开环形成醛基,然后还原而完成。这样的过程才能解释只有一个氘原子留在产物中的结果。Oshima等还发现脱氧脱氨甲酰基类毒素是由氢离子轰击C-6阳碳离子代替C-13甲基的失去质子而形成。Y.Shimizu通过使用(2-13C)标记的乙酸和(甲基-13C、2H3)标记的蛋氨酸的喂养实验逐步证实了甲基上的氢没有重排到C-6位置上。这些实验结果证实了saxitoxin衍生物的特别少见的生物合成途径。乙酰基和α-氨基酸的缩合也是有先例的。一个众所周知的例子是在porphyrin的生物合成中,琥珀酸酯和甘氨酸缩合形成δ-aminolevulinate。类似的例子是在抗生素arphamenineA和B的生物合成中发现的,乙酸酯和精氨酸的α-胺基缩合,随后脱去羰基。这个新的合成途径也包含了乙酸酯的不同的来源,这就解释了所观察到的两个被合并的乙酸单元的差异。Y.Shimizu等学者的研究工作解释了产毒甲藻生物合成麻痹性毒素时,其环状结构中所有碳的来源。对于剩余的一个碳C-13,通过喂养和母体化合物实验,其结果不能产生特殊的同位素丰度,认为是来自于一个单独的碳单元,是由CO2经由malonate过程在较早的时期衍生而来。2磺酰化的毒素在正体中的平衡转化存在磺酰基偶联是这类毒素的另一个结构特点。事实上,大部分甲藻中的毒素衍生物的磺酰基偶联发生在11位O上和羰酰基N上的偶联。N上磺酰基的偶联在天然产物中是相当罕见的。已知只有β-lactams和aminopolysaccharides很少的例子。这些N-磺酰基极易被弱酸水解,也可以被生物系统中的N-磺酰酶水解。甲藻中磺酰化毒素的形成是否先于未磺酰化产物的形成还不清楚。然而已经证实在贝类中O-磺酰化产物的还原裂解产生未磺酰化的毒素如saxitoxin。类似的neosaxitoxin系列物的N上的-OH能够被还原除去。而且N-OH衍生物是否是saxitoxin系列物的前体也并不知道。磺酰化的毒素与其差向立体异构体之间也存在平衡转换。在室温下,毒素羰酰基N上和11位O上的磺酰基偶联结构(1)逐渐转变为与它的差向立体异构体1:2的混合物。一个类似的平衡在11位O上磺酰基偶联结构(2)与其差向立体异构体之间也被发现。当用tris缓冲液电泳时,毒素(1)迁移到阳极,而其他的毒素迁移到阴极。表明(1)携带净的负电荷。当(1)用0.1mol/LHCl37℃处理7d或用0.05mol/LHCl85℃处理30min,则发现完全定量转化为其差向立体异构体结构。(1)和它的差向立体异构体的混合物用类似的酸处理则形成(2)和其差向立体异构体的混合物。这些结果表明,结构(1)是结构(2)附加一个磺酰基的衍生物。这些磺酰化的羰基比普通的氨基磺酸盐或酯更容易酸水解。毒素的结构在生物体中也存在类似的转换。Y.Shimizu等通过将染毒贝组织解剖,不同的组织分别用pH=5.8的乙酸盐缓冲液处理,单独保温放置一定时间后,再测定毒素的成分和含量。剔除贝壳肌的贝组织匀浆样在处理放置3d后的全部毒性没有变化,但毒素的成分却发生了显著的变化,saxitoxin的含量增加了56.3%,其他的毒素gonyatoxin-Ⅰ、gonyautoxin-Ⅱ、gonyautoxin-Ⅲ、neosaxitoxin分别减少了12.2%、15.3%、4.1%和18.2%。这一结果指出毒素在贝组织中的转化是以saxitoxin为最终产物。还发现鳃组织的全部毒性和毒素组分在处理放置前后均没有变化。足肌的匀浆样经处理放置后,saxitoxin的含量增加了59.0%,其他的毒素gonyautoxin-Ⅰ、gonyautoxin-Ⅱ、gonyautoxin-Ⅲ、neosaxitoxin分别减少了11.8%、17.7%、4.4%和19.5%。足肌的变化非常类似剔除贝壳肌的贝组织的变化。足肌具有运动的功能,在这样的肌肉中富含大量的酶参与氧化还原反应,因此毒素的结构通过酶催化的氧化还原反应而发生变化是显而易见的。3关于赤潮藻毒素在甲藻生物合成机制的研究在我国随着有毒赤潮发生次数的增加,构成了对公众健康和水产养殖业的日益严重的威胁,因此有关有毒赤潮藻毒素的研究日益引起重视,也取得了一些进展。近年来陆续有一些我国双壳贝类体中麻痹性贝毒和腹泻性贝毒含量的调查报道。结果显示两种毒素在我国南北沿海均普遍存在,南方海域检出率和含量较高。对麻痹性贝毒的研究更为深入,对其成分、积累、转化和排出等方面的研究都有一些报道。但对于赤潮藻毒素在甲藻中的生物合成机制的研究还未见报道。有机物分泌代谢有毒化合物的生物学意义