响应面法优化喷雾干燥生产脂肪酶培养基

响应面法优化喷雾干燥生产脂肪酶培养基

脂肪酶是一种分解和合成脂肪的酶。脂肪酶不仅可以催化酯水解反应还可以催化酯合成反应和转酯反应。卡门柏青霉脂肪酶有其它许多微生物脂肪酶不具备的优点。耐高温,最佳反应温度为48℃。对甘油三酯有1,3位的专一性。有特殊的底物专一性,这些是扩展青霉和圆弧青霉脂肪酶不具备的性质。因此卡门柏青霉脂肪酶有很高的应用价值和研究意义。青霉的生长和脂肪酶合成受到培养基中各种成分的影响如碳源、氮源、无机盐等。谭天伟等对卡门柏青霉产脂肪酶培养基组分的选择进行了优化。确定培养基的质量浓度(kg/L):脱脂豆粕0.04,霍霍巴油0.005,磷酸氢二铵0.001,磷酸氢二钾0.005,吐温600.005。本文以此为基础进行培养基各组分浓度的优化。采用响应面方法(Responsesurfacemethodology,RSM)在多因子起作用的生化过程中,可以快速地找出主要因子,逼近最大响应区间,拟合出数学模型方程,并且找到最优化条件,对结果进行评估。随着计算方法的完善和微机应用的普及,响应面方法已被成功应用于科学研究的许多领域,但在微生物发酵方面应用的还不是很广泛,特别是在青霉脂肪酶的发酵方面还没有见到报道。1实验部分1.1脂肪酶的发酵与酶活性的测定1.1.1病毒卡门柏青霉(PenicilliumcamembertiiThom)为实验室保存菌种1.1.2灌装、冷却麦芽汁50mL,水50mL,琼脂2.5g。加热沸煮30min,使之完全溶解,倒斜面灭菌备用。摇瓶种子培养基质量浓度(kg/L)脱脂豆粕0.04,硫酸铵0.001,磷酸氢二钾0.005。摇瓶中发酵培养基质量浓度(kg/L)脱脂豆粕0.04,霍霍巴油0.005,磷酸氢二铵0.001,磷酸氢二钾0.005。1.1.3保存“4”的冰青霉斜面种子在28℃恒温培养箱培养4d,长出大量菌丝后,将其放入4℃的冰箱中保存。每次挑取一环菌丝到内装50mL种子培养基的250mL锥形瓶中,在温度28℃转速220r/min的条件下震荡培养48h,作为种子液接入发酵液培养基。1.1.4发酵液温度对酶活性的影响在无菌条件下移取2mL种子液到内装50mL摇瓶发酵培养基的250mL锥形瓶中,在温度28℃转速220r/min的条件下震荡培养,定时取样,用纱布过滤发酵液,取上上清液测酶活性。1.1.5乳化液的配制脂肪酶活性测定采用乳化系统。质量浓度0.02(kg/L)的聚乙烯醇溶液与橄榄油体积比3∶1混合并搅拌均匀制成乳化液。取5mL乳化液,4mL0.1mol/L的磷酸缓冲液(pH7.0),1mL酶液,37℃反应10min,加15mL体积分数为95%乙醇中止反应,以酚酞作指示剂,用0.05mol/LNaOH溶液滴定。1.2实验设计1.2.1/4部分因子本实验培养基中的成分主要包括以下组分霍霍巴油,脱脂豆粕,K2HPO4,(NH4)2HPO4,TWEEN60。采用5因素2水平的1/4部分因子实验设计,实验次数为8。拟合出线性方程b=a0-a1ρ1-a2ρ2-a3ρ3-a4ρ4+a5ρ5(1)式中ρ1ρ2ρ3ρ4ρ5分别为霍霍巴油,脱脂豆粕,K2HPO4,(NH4)2HPO4,TWEEN60的质量浓度(kg/L);b发酵液中脂肪酶活性浓度(mmol/s·L);a0为方程系数(mmol/s·L);a1a2a3a4a5分别为方程中质量浓度(mmol/s·kg)。1.2.2最陡峭的倾斜测试找出主要因素之后,通过使主要因素同时朝响应值增大的方向变化,找出峰值,从而逼近最大响应区间。1.2.3i2iii2+s12i2/b2对于2因素5水平的中心组合实验共需要13次实验。拟合出一个二次多项式方程。该方程为描述响应变量(因变量)与自变量的经验模型。对于2因子系统,模型可表述为b=b0+b1ρi+b2ρj+b12ρiρj+b11ρ2ii2+b22ρ2j(2)上式中,ρi、ρj为由部分因子实验确定对响应值影响显著的两个培养基的质量浓度(kg/L);b为预测响应值即发酵液中脂肪酶活性浓度(mmol/s·L);b0为方程系数(mmol/s·L);b1,b2为质量浓度(mmol/s·kg);b12为乘积项系数(mmol·L/s·kg2);b11、b22为平方系数(mmol·L/s·kg2)。用统计软件SAS/Statistic(Version8.1)对实验进行回归分析,其中回归系数的显著性用t检验,用F(Fischer)检验评价数学模型方程的显著性,方程的拟合性由确定系数R2决定。2结果与讨论2.1脂肪酶活性测定结果采用基础培养基质量浓度(kg/L)脱脂豆粕0.04,霍霍巴油0.005,磷酸氢二铵0.001,磷酸氢二钾0.005,吐温600.005。发酵100h的脂肪酶活性浓度为2.85(mmol/s·L)。首先在此基础上找到对酶活性影响最大的几个因素。采用部分因子设计法,对于5个因素需要25-2次实验即8次,试验设计见表1。为了统一各次实验结果,在100h取出摇瓶测酶活性作为响应值。原始的培养基浓度作为-1水平,125%的原始的培养基浓度作为1水平。回归分析得到结果如表2。从结果可以看出在表1中当脱脂豆粕和磷酸氢二铵处于低水平的时候脂肪酶的酶活性比它们处于高水平的时候的酶活性要高出许多,而且通过回归分析得到一个多元线性的拟合方程:b=a0-a1ρ1-a2ρ2-a3ρ3-a4ρ4+a5ρ5表2中列出了方程各项的系数,数学计算出的各项系数的标准误差,t表示各因素对酶活浓度影响的显著性因子,Pr>|t|的值表示显著的概率范围,R2表示方程的方差。对方程进行方差分析,在90%的水平上方程的回归是显著的。而且确定系数R2=0.97,表明97.29%的数据可以用此方程解释。各因素对酶活性浓度影响的显著水平可以从表2看出,在95%的水平上脱脂豆粕和磷酸氢二铵差异显著。其它因素在这个水平上差异都不显著。而且从方程的系数可以看出霍霍巴油,脱脂豆粕,磷酸氢二钾和磷酸氢二铵都是负的,它们对酶活性的作用属于负效应。在原始培养基的基础上逐渐减少这些组分的浓度对产酶有利。这说明培养基浓度过高对青霉产脂肪酶有抑制作用,其中脱脂豆粕和磷酸氢二钾的抑制作用特别显著,而其它几个因素的变化对产酶的影响在90%的水平上不显著,均固定在-1水平上。所以选取脱脂豆粕和磷酸氢二铵质量浓度这两个因素作为中心组合实验的研究对象。2.2脂豆酸和磷酸氢二铵质量浓度对酶活性的影响针对脱脂豆粕质量浓度和磷酸氢二铵质量浓度进行最陡爬坡实验,如表3所示。由于脱脂豆粕和磷酸氢二铵对产酶是负效应作用,所以将它们的浓度逐渐减少以寻找最大响应区域。脱脂豆粕和磷酸氢二铵的质量浓度每次减少0.0025kg/L和0.00125kg/L。发现2号实验脱脂豆粕和磷酸氢二铵质量浓度分别为0.035kg/L和0.0075kg/L时酶活性达到最大值,然后随着浓度继续减少酶活性不断降低。2号实验的质量浓度接近最大响应区域,使之作为中心组合实验的中心点。2.3回归结果的方差分析用SAS8.1软件设计中心组合实验,采用22全因子中心组合实验,需要2因素5水平共13次实验。5水平的设计,其中中心点取最陡爬坡实验最大值时的浓度数值。中心组合实验的设计及响应值结果如表4所示。采用二元二次回归方法,计算机拟合出一个二次方程b=b0+b1ρ2+b2ρ4+b11ρ2-2+b12ρ2ρ4+b22ρ24(3)表5中列出了方程各项的系数,数学计算出的各项系数的标准误差,t表示方程中各项对酶活性浓度影响的显著性,Pr>|t|的值表示显著的概率范围,R2表示方程方差,F表示方程与实验结果拟合程度的显著性因子,Pr>F的值表示显著的概率范围。对回归结果进行方差分析,从表5中可以看到,对于二次多项式各项对响应值的影响大小用t检验来评价。其中ρ2和ρ4的检验结果显示在95%的概率水平上它们对响应值的影响是显著的,ρ2222和ρ2442在99%的概率水平上对响应值的影响显著。而ρ2ρ4在90%的水平上对方程影响都不显著。用F检验评价方程,得到概率水平在99%的条件下回归是显著的(P<0.002177)。方程的有一个较高的确定系数(R2=0.9),说明90%的试验数据可以用这个方程解释。图1中绘制了方程的三维响应面。以脱脂豆粕质量浓度和磷酸氢二铵质量浓度作为平面坐标,以脂肪酶酶活性浓度作为响应值。从图中可以找到一个最大酶活性浓度值。通过软件计算得到,脱脂豆粕质量浓度为0.03443kg/L,磷酸氢二铵质量浓度为0.00071kg/L时,预测酶活性浓度最大值为4.01mmol/s·L。为了验证预测值,在这两个点做重复实验,三次实验的平均酶活性浓度为4.08mmol/s·L。基本与数学模型得到的最大酶活性符合,说明数学响应面法优化得到的数学模型与实验数据拟合的较好。3最佳配方的确定和组合拟合本实验成功的将响应面分析方法应用到青霉脂肪酶发酵的优化过程中,并且得到了较好的结果。实验首先通过部分因子研究了培养基中各组分对脂肪酶酶活性的影响,找出了影响显