第四章 海洋动物细胞培养仪器设备的 清洗和消毒

第四章细胞培养用品的清洗、消毒一、细胞培养的要求1、消毒细胞培养的最大危险时发生培养物的细菌、真菌和病毒等微生物的污染。污染主要是由于操作者的疏忽而引起，常见原因有操作间或周围空间的不洁，培养器皿和培养液的消毒不合格或不彻底等等。消毒方法分类物理灭菌法（紫外线、湿热、干热、过滤等）化学灭菌法（化学消毒剂、抗生素）

干热法

杀菌机制：使菌体脱水干燥、大分子变性。

80－100℃1h可杀死繁殖体，160－170℃2h可杀死芽胞。常用方法有焚烧、干烤等。热力灭菌法

a、紫外线消毒用于空气、操作台表面和不能用其他方法进行消毒的培养器皿紫外线的杀菌波长范围为240—280nm，265~266nm的作用最强。其主要是使DNA上相邻的嘧啶通过共价键结合形成二聚体，影响DNA的正常碱基配对。紫外线的穿透力很弱，其杀菌只限于表面的照射。MechanismofUltravioletRadiation

thymine-thyminedimmers

b、湿热消毒高压蒸汽消毒，使用最广泛、效果最好的消毒方法。橡胶制品、玻璃器皿、金属器械。湿热法

杀菌机制：在水分子存在情况下更易于使菌体蛋白凝固，热力穿透性更强。1、巴氏消毒法（pasteurization）

61.1-62.8℃30min；71.7℃15-30s。2、高压蒸气灭菌法（autoclaving）

121.3℃15-20min可杀灭包括芽胞在内的所有微生物。3、煮沸法：100℃5min杀死细菌繁殖体。c、过滤除菌不能采用高压消毒的方法进行灭菌处理，如血清、培养液等Filtration滤过sterilize

solutionsthatmaybedamagedordenaturedbyhightemperaturesorchemicalagents(cellculturemedium,serum……)d、化学消毒法75%酒精主要用于操作者的皮肤、台面及无菌室内的壁面处理。1%新洁尔灭主要用于器械的浸泡化学消毒灭菌法根据作用机制不同，主要有以下几类：

1.使菌体蛋白质变性或凝固todenatureproteinsofbacterialcell

酚类---石碳酸、来苏、洗必泰等。醇类---70%~75%乙醇杀菌力最强。重金属盐类---红汞等。烷化剂---甲醛等，杀菌力强，但毒性大，有致癌性。2.干扰细菌的酶系统和代谢

tointerfereenzymaticsystemandmetabolismofbacterium氧化剂---过氧化氢、高锰酸钾等，与细菌的酶结合使之失去活性。过氧乙酸对细菌繁殖体和芽胞、真菌、病毒都有杀灭作用。3.损伤菌细胞膜

todamagecellmembraneofbacterium表面活性剂：新洁尔灭等增加菌细胞表面张力，并增加其通透性使细菌破裂。化学消毒剂:碘伏等大多对人体组织有害，只能外用或环境消毒。e、抗生素灭菌用于培养用液或预防培养物污染。常用抗生素为青霉素及链霉素。f、电离辐射灭菌用Co60产生的射线照射48-72h用高能电子束照射。消毒方法的选择实验室环境的消毒培养器械的消毒培养用液体的消毒2、实验前的准备根据要求准备好瓶管盘架、器械消毒盒等准备器材数要大于实际使用数，瓶盖数大于瓶数、将所需物品一并放入超净台内。3、无菌室和操作台消毒无菌室每周用过氧乙酸加紫外线消毒1-2次超净台常用酒精擦拭实验前无菌室及超净台紫外消毒。4、无菌操作要求（1）手指不能触及器材使用端。（2）减少手与器材的接触面积，学会手指操作。（3）一切操作，如打开或封闭瓶口、安装吸管、注射器等，都要在火焰前方进行，使用端用前要经过火焰消毒。

4、无菌操作要求（4）瓶口要顺风斜放在支架上。试剂使用后应立即封闭瓶口，若长时间敞口，会增加落菌的机会。（5）细胞培养各种用液要专管专用，并要勤换洗管，防止扩大污染和交叉污染。

4、无菌操作要求（6）瓶口液滴不能再倒回瓶内，要用于酒精棉球擦拭，瓶口要再经火焰消毒。（7）操作者动作要准确敏捷，尽量避免空气流动。

4、无菌操作要求（8）工作台面上的用品要放置有序，布局合理，一般来讲，酒精灯要放在当中，右手使用的物品在右侧，左手使用的物品在左侧。

注意事项1、双手2、避免烫伤细胞3、讲话，咳嗽4、人员走动5、培养用品的清洗玻璃器皿基本程序：浸泡，刷洗，浸酸，冲洗4个步骤。洗液的配制洗液的配制（1）根据具体情况，选择大小适宜的耐酸器皿，加入一定量的去离子水。（2）按照比例，将重铬酸钾荣于去离子水中，为了充分溶解，边加边用玻璃棒搅拌。（3）溶解完全后，将浓硫酸缓慢加入溶液中。（4）洗液降到常温后，既可用来清洗器皿5、培养用品的清洗玻璃器皿（1）、浸泡新买的玻璃器皿自来水初步洗刷，5%稀盐酸浸泡过夜。使用后的立即进入清水中，避免器皿内蛋白质干涸后粘附于玻璃上。浸泡是要将器皿完全进入水中，无气泡空隙5、培养用品的清洗玻璃器皿（2）、涮洗防止损坏器皿表面光洁度，选择软毛刷，但不能留死角。涮洗后要将洗涤剂冲净，晾干。5、培养用品的清洗玻璃器皿（3）、清洁液浸泡洗液中泡24小时，注意玻璃器皿中不要留有气泡5、培养用品的清洗玻璃器皿（4）、冲洗必须用流水冲洗，流水灌满，倒掉，重复10次以上，直到清洁液全部被冲净，不留任何残迹。蒸馏水漂洗2-3次，三蒸水漂洗1次，烘干备用5、培养用品的清洗胶塞、盖子等杂物塑料器皿6、包装一般采用牛皮纸、硫酸纸、棉布等作为包装材料对培养瓶、滤器、吸管等的瓶口部分作局部包装密封。对比较小的培养皿、吸头等可以全包装注射器、金属器械可直接放入铝饭盒内。瓶装玻璃器皿的包扎与消毒1、依据要包扎的对象，剪取食以大小的包扎纸。2、将包扎纸盖在瓶口上进行包扎，3、灭菌，121℃，20min.4、备用管状培养器皿的包扎与消毒1、用脱脂棉塞入上端管口，松紧适当，防止移取液体时吸尔球造成污染。2、用一层牛皮纸螺旋状包扎。3、包好的吸管、滴管统一装到金属吸管筒中，盖好盖子。4、灭菌。注意事项1、包装时手指与器材接触面积要小，手指不能触及器材的使用端。2、封闭器材使用端，标记器材手持端3、小包装4、玻璃管道口（尖吸管、移液管手持段等）加棉花正压滤器的安装使用正压滤器的安装使用