不同氮源对苹果白术发酵过程的影响

不同氮源对苹果白术发酵过程的影响

苹果是由饮酒和提取的新果酒精蒸馏而成的。酵母菌在苹果白兰地发酵过程中起着至关重要的作用,其发酵力的好坏,副产物的多少,不仅直接影响产量的高低,而且间接影响产品风味。目前在发酵过程中发酵缓慢甚至停滞现象仍然是很普遍的问题。因此寻找解决苹果白兰地发酵中糖的利用率和糖酒转化率的方法是亟待解决的问题。氮源是酵母生长所必需的营养物质之一,苹果汁中含有足够酵母生长所必须的碳水化合物,但氮源含量较低,不足以满足酿酒酵母在发酵过程中的生长,从而会导致发酵酒精度低残糖量高的现象。因此在发酵中添加适宜的氮源,将会有利于酵母的生长及提高苹果白兰地的产量和质量,降低成本,提高经济效益。本工作以氯化铵、蛋白胨、磷酸氢二铵、L-精氨酸为研究对象,研究氮源种类及浓度对苹果白兰地酒精发酵的影响,以期为苹果白兰地发酵提供一种新方法,为氮源在发酵中的应用提供理论依据和实践指导。1材料和方法1.1材料和分析方法酿酒酵母1023和1620由中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)提供;斜面培养基采用PDA培养基(马铃薯20%,葡萄糖2%,琼脂2%,pH自然);种子培养基采用PDA液体培养基(装液量100mL/250mL,pH自然);富士苹果采自于甘肃庆阳静宁县;氯化铵分析纯,天津奥博凯化工有限公司;蛋白胨生化试剂,北京奥博星生物技术有限责任公司;磷酸氢二铵分析纯,天津光复精细化工研究所;L-精氨酸生化试剂,天津光复精细化工研究所;焦亚硫酸钠分析纯,天津市恒兴化学试剂制造有限公司。2WY-2102型恒温培养箱、ZHJH-C11128型超净工作台上海智城分析仪器制造有限公司;TD50002型电子天平余姚市金诺天平仪器有限公司;B204LED型生物显微镜重庆奥特光学仪器有限公司;YXQ-LS-75G型立式压力蒸汽灭菌锅上海博迅实业有限公司医疗设备厂;RE5205型旋转蒸发仪上海亚荣生化仪器厂;Breville-BJE500F型榨汁机澳大利亚铂富公司。1.2实验方法1.2.1工艺1.2.2存储液的制备将酿酒酵母保藏菌种转接于新鲜试管斜面,28℃培养48h;4℃冰箱保存备用。从保存的斜面培养基中用接种环挑去6环菌苔接种于装有100mL液体种子培养基的250mL三角瓶中,28℃、150r/min摇床培养48h,4℃冰箱保存备用。1.2.3氮源种类对装复量的影响在苹果白兰地酒发酵基础培养基中添加不同浓度的氯化铵、蛋白胨、磷酸氢二铵、L-精氨酸作为氮源,每种氮源设置对照、100、150、250、400、550、700mg/L七个水平,分别装于1000mL三角瓶,每瓶600mL,重复3次。1.2.4苹果白兰地酒发酵培养制度将活化好的两种酿酒酵母按照1∶1比例接种于600mL苹果白兰地酒发酵培养基中,接种量为6%,接种浓度为106cfu/mL,然后于20℃下厌氧静置发酵6d。1.2.5分析1.2.5.1.糖、总酸和酒精的测定依据GB/T15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》对糖量、总酸、酒精度等理化指标进行测定。1.2.5.酵母发酵力的测定采用失重法,以单位体积和时间下二氧化碳挥发产生的失重来衡量酵母发酵力的大小,即酵母发酵力(g/(L·h))=(发酵前称重-发酵后称重)/(发酵液体积·发酵时间)。1.2.6数据分析2结果与分析2.1对二氧化碳释放的影响酵母发酵力是指酵母产酒精的能力,在厌氧条件下酵母产生酒精与二氧化碳,发酵结束二氧化碳挥发产生失重,以失重来衡量酵母发酵力的强弱。不同氮源处理对苹果白兰地酒精发酵力的影响如图1~图4所示。由图1~图4可知,各处理的酵母发酵力均显著高于对照(p<0.05),其中,氯化铵处理为250mg/L时二氧化碳释放量最大,而与700、550、400mg/L处理相比差异不显著(p>0.05);蛋白胨处理为400mg/L时二氧化碳释放量最大,与150、100mg/L及对照浓度处理相比差异显著(p<0.05);磷酸氢二铵处理为250mg/L时二氧化碳释放量最大,与550、400mg/L处理相比差异不显著(p>0.05);L-精氨酸处理为550mg/L时二氧化碳释放量最大,而与250mg/L处理相比差异不显著(p>0.05)。由图1~图4可知,与对照二氧化碳失重量较低,相比较,添加氮源可以明显加快发酵速度,增加二氧化碳失重量,提高酵母酒精发酵力,且无机氮源酵母酒精发酵力低于有机氮源。2.2其他处理残糖量残糖是酒精发酵后未被发酵而残余的糖,残糖高低是衡量酒精发酵完全程度的重要指标。残糖偏高意味着产酒率偏低,糖不能有效地转化为酒精。不同氮源处理对苹果白兰地酒精发酵残糖的影响如图5~图8所示。由图5~图8可以看出,除了蛋白胨100mg/L处理对残糖的影响与对照无明显差异外,其他三个处理的各个浓度与对照相比差异均显著(p<0.05)。其中,氯化铵和磷酸氢二铵添加量均为250mg/L时残糖量最小,但250mg/L氯化铵与550、400mg/L处理相比差异不显著(p>0.05),250mg/L磷酸氢二铵与400mg/L处理相比差异不显著(p>0.05);蛋白胨添加量为400mg/L时残糖量最小,与550mg/L差异不显著(p>0.05);而L-精氨酸处理为550mg/L时残糖量最小,与700、250mg/L处理相比差异不显著(p>0.05)。实验结果表明,同空白对照降糖较慢相比,添加氮源可以加速糖的降解,提高糖酒转化率,增加酒精产量。从图5~图8中还可以看出发酵后糖利用率整体偏低,经分析认为可能是初始发酵糖度过高,随着酒精浓度的增加,酵母容易受到高浓度酒精的抑制,从而不能充分利用发酵液中的糖,导致糖利用率偏低。2.3发酵温度和氮源浓度对发酵酒精度的影响酒精度表示酒中含乙醇的体积百分数,体积百分数越大,说明酵母发酵糖产生的乙醇越多。不同氮源处理对苹果白兰地发酵酒精度的影响如图9~图12所示。从图9~图12结果可以看出,除了蛋白胨及磷酸氢二铵100mg/L处理的酒精度分别低于、与对照无差异以外,其他各处理的酒精度均显著高于对照(p<0.05),其中,氯化铵和磷酸氢二铵处理都为250mg/L时酒精度最高,但氯化铵与400mg/L处理相比差异不显著(p>0.05),而磷酸氢二铵则与700、400、150mg/L处理相比差异不显著(p>0.05);蛋白胨处理为400mg/L时酒精度最高,与700、550mg/L处理相比差异不显著(p>0.05);而L-精氨酸处理为550mg/L时酒精度最高,与700、250mg/L处理相比差异不显著(p>0.05)。由图9~图12结果可知,在相同的发酵条件下,无机氮源发酵酒精度低于有机氮源,其中无机氮源中以氯化铵在水平250mg/L下酒精度最高,有机氮源中以蛋白胨在水平400mg/L下酒精度最高。因为苹果汁中氮的含量是影响酵母生长及发酵速率的主要因素,低温发酵时有机氮源氨基酸在酵母对数期时可被大部分利用,而无机氮源更多的是用于酵母生物量的生成。Beltran等的研究结果表明,有机氮源氨基酸在整个发酵过程中对酵母细胞代谢非常重要,而无机氮源铵盐则在发酵后期很难被利用,以上研究结果支持本实验有机氮源发酵酒精度高于无机氮源的结果。以上结果还表明,氮源浓度在150mg/L以上发酵酒精度与对照相比有显著差异,但随着氮源浓度的增加,酒精含量并不与氮源浓度呈直线关系。氮源不足会导致酒精发酵缓慢甚至停滞现象的发生,其他一些研究证实,防止发酵不彻底的氮源最小值大概是140mg/L,而在实际发酵中,氮源的最小值还受酵母菌种、生长繁殖条件及发酵环境的影响,这个结论只是一个粗略估计。而足量的氮源可以提高酵母菌的发酵速率并可以缩短发酵周期,但氮源浓度过高也会导致酒精度的下降,因为氮源浓度过高会使发酵过程出现氮分解代谢产物阻遏(NCR)状态,而此状态会降低铵盐和氨基酸透性酶基因(GAP1和MEP2)的表达,影响细胞对氮源的转移及吸收,由于NCR状态下氮与糖的代谢高度相关,同样也会影响糖代谢进而不利于酒精的积累,同时过量的氮源会造成微生物危害及生物胺生成,对酒的稳定性及品质产生消极影响。2.4不同氮源、对总酸的影响苹果白兰地总酸是苹果原汁酸和酵母代谢酸的总和,苹果白兰地总酸的高低,关系到苹果白兰地酒的质量和口感,不同氮源处理对苹果白兰地酒精发酵总酸的影响如图13所示。总酸变化量是指苹果白兰地酒发酵前后总酸含量的差值,本实验在苹果白兰地酒发酵过程中,处理及对照总酸变化量都有所增加。由图13可以看出,无机氮源发酵后总酸变化量较有机氮源明显,个别浓度处理的总酸变化量与对照相比差异显著(p<0.05),并随着氮源浓度增加总酸变化量有增加的趋势,经分析认为氯化铵和磷酸氢二铵都是生理酸性氮源,氨氮利用后游离出来的酸根使发酵后总酸增加;而有机氮源不同浓度处理后的总酸变化量与对照相比,不但没有显著增加,反而多数浓度处理后的总酸变化量低于对照。因此,酒精发酵过程中,总酸可以受到不同氮源及浓度的影响。3发酵过程中酵母粉添加量的变化3.1苹果白兰地酒精发酵中适当添加氮源对苹果白兰地酒发酵有一定促进作用。在相同的发酵条件下,添加氮源可以提高酵母酒精发酵力,加速糖的降解,提高糖的转化率。3.2无机氮源发酵酒精度低于有机氮源,添加氮源后,氮源浓度在150mg/L以上发酵酒精度与对照差异显著,但随着氮源浓度的增加,酒精含量并不与氮源浓度呈直线关系,其中无机氮源中以氯化铵在水平250mg/L下酒精度最高,有机氮源中以蛋白胨在水平400mg/L下酒精度最高。3.3发酵过程中总酸的变化受苹果汁中氮源种类及浓度的影响,无机氮