植物激素脱落酸诱导气孔安保细胞信号转导途径的研究进展

植物激素脱落酸诱导气孔安保细胞信号转导途径的研究进展

植物叶片表面由一对保护细胞组成，通道有利于植物与环境之间的水和气体交换。气孔的开、闭运动过程对环境条件的变化均有灵敏和准确的反应。在过去几十年中,气孔保卫细胞一直是植物生物学家研究高等植物细胞信号转导的模式材料。作为模式材料,保卫细胞有其独特的结构和生理意义:首先,它与高等植物的其它大多数细胞不同,成熟的保卫细胞缺乏具有生理功能的胞间连丝,因而与其周围的细胞是分离的,这种分离便于对单个细胞直接进行测定(Blatt和Grabov1997);第二,保卫细胞能对多种刺激如光(红光和蓝光)、空气湿度、脱落酸(ABA)、生长素等迅速作出反应,这些刺激可迅速改变离子的运输,引起无机渗透势的变化,并且同时发生保卫细胞体积的改变。作为逆境信号的ABA,其在植物生长发育中的生理意义以及ABA对气孔调节的显著效应已使许多科学工作者对其作用机制产生了浓厚的兴趣,人们对于ABA在保卫细胞信号转导中的作用机制的认识也比对其它刺激因子(如光、CO2、湿度等)的作用机制的认识深刻(Assmann1993,Li等2000,Pei等2000,Schroeder等2001)。另外,模式材料拟南芥(Arabidopsisthaliana)的应用也为人们深入研究这一信号转导过程提供了方便。到目前为止,有关ABA对气孔运动调节的轮廓已初步勾画出,即ABA与膜受体结合,产生肌醇三磷酸(IP3)和环腺苷酸二磷酸核糖(cADPR),以激活胞内钙库中Ca2+的释放,同时胞外Ca2+也可经过质膜上的Ca2+通道(Ca2+channels)内流,从而使胞内Ca2+浓度([Ca2+]i)升高;另外ABA还可诱导胞质碱化(pH升高)。胞内[Ca2+]i和pH升高可通过调节胞内蛋白激酶/蛋白磷酸酶的活性而调节质膜上相关的离子通道,如激活质膜上阴离子通道(anionchannels)和K+外流通道(K+outchannels)、钝化K+内流通道(K+inchannels),从而诱导气孔关闭或抑制气孔开放(图1)。但这些因子在ABA信号转导中的时序在不同植物中可能还有一定的差异。本文将在对气孔保卫细胞研究中所用的新技术做简要介绍的基础上对ABA信号转导过程作一简单的概述。1气孔保细胞信号转导机理尽管人们对气孔运动研究的历史已有百年,但对其信号转导途径的认识还不清楚。最近几年由于各种荧光探针的不断出现以及激光扫描共聚焦显微术(laserscanningconfocalmicroscopy,LSCM)、膜片钳(patch-clamp)技术和分子生物学技术的结合应用,人们对气孔保卫细胞的信号转导机制有了较深入的了解。1.1ca2+荧光探针方法激光扫描共聚焦显微镜是80年代发展起来的一种细胞生物学分析仪器。它在荧光显微镜基础上加装了激光扫描装置,用紫外或可见光激发荧光探针,便于在细胞或亚细胞水平上观察诸如Ca2+、pH值、膜电位等生理信号及细胞形态的变化,并利用计算机进行图像处理,从而成为形态学、分子细胞生物学、神经科学、药理学、遗传学等领域中新一代强有力的研究工具。激光扫描共聚焦显微镜以其优良的空间和时间分辨率,以及“光学切片”和三维重组功能,结合荧光探针的应用,使我们能对活体细胞的多种功能进行精确的动态分析。胞内Ca2+作为第二信使,在植物信号转导过程中起着重要的作用。在过去几十年中虽然建立起多种测定胞内游离Ca2+浓度([Ca2+]i)的方法,如微电极、水母发光蛋白及原子吸收光谱等,但目前在保卫细胞中得到广泛应用的仅有荧光指示剂法。McAinish等(1995)用显微注射将Indo-l导入鸭跖草中,成功地观测到细胞内Ca2+浓度的瞬间变化及三维空间中Ca2+的分布。Allen等(1999,2000)用Ca2+荧光指示剂YC2.1(yellowcameleon2.1)标记拟南芥保卫细胞,发现ABA可诱导胞质[Ca2+]i呈忽高忽低的振荡(oscillation)现象,而这种“振荡”是ABA诱导气孔关闭的早期信号之一。pH调节是活体细胞内重要的生理过程。Roos等(1998)应用SNARF-1-AM[5-(and-6)-carboxyseminaphthorhodafluor-1-acetoxymethylester]研究发现,胞内不同区域pH的变化与胞内一些生物碱的合成有关。我们应用SNARF-1-AM标记蚕豆气孔保卫细胞,利用激光共聚焦显微技术研究发现,外源H2O2可诱导保卫细胞胞质碱化,液胞酸化,从而得出胞质碱化可能是H2O2诱导气孔关闭的一个重要中间因子的结论(Zhang等2001a)。可选择不同的荧光探针检测活性氧(主要为H2O2)。常用荧光探针有2,7-二氯二氢荧光素乙酰乙酸(2,7-dichlorodihydrofluorescindiacetate,H2DCFDA)。其原理是不发光的H2DCFDA进入细胞后在过氧化物酶的作用下与胞内的H2O2反应从而被氧化分解为二氯荧光素DCF(dichlorofluorescin,DCF),DCF的荧光强度与H2O2的浓度呈线性关系,据此来确定胞内H2O2的相对含量。最近,Pei等(2000)和Zhang等(2001c)分别利用H2DCFDA标记拟南芥和蚕豆气孔保卫细胞,并对ABA诱导气孔关闭的机制进行研究,发现ABA可诱导保卫细胞产生H2O2,H2O2可通过激活质膜Ca2+通道而导致胞外Ca2+内流,进而得出H2O2可能是ABA诱导气孔关闭这一信号转导链图中的一个新成员。1.2膜片钳技术、k+通道保卫细胞质膜上存在着多种离子通道,对它们的鉴定与识别是理解信号转导的重要环节。80年代初期发展起来的膜片钳技术,可以研究离子通道的动态变化,使人们对离子通道在气孔运动中的作用有了更深入的理解。膜片钳技术是在电压钳的基础上发展起来的,其原理基于通道蛋白活动时产生一个微弱的电流变化(10-12安培,pA),应用电子线路将膜上一个通道电位固定在一定水平上,观察并记录流经该通道的电流,从而了解该通道的特性。植物中的K+通道则是由Schroeder等(1984)最早报道的,他们利用膜片钳技术,首次在蚕豆的保卫细胞中检测出了K+通道的存在。之后,该技术逐渐成为鉴定保卫细胞中离子通道的主要手段。目前在保卫细胞中已鉴定出多种K+通道、阴离子通道及Ca2+通道(MacRobbie1998)。1.3脱辅基蛋白和咪唑并哌嗪荧光光谱分析Knight等(1992)用转基因技术建立了一个检测胞内Ca2+浓度的数字成像方法。水母蛋白是钙敏感的发光蛋白,从水母(Aequoreavictoria)中纯化得到。它是由一个脱辅基蛋白(脱辅基水母蛋白)和一个咪唑并哌嗪发光基团组成,与Ca2+作用时,后者被氧化为coelenteramide,并辐射出光。在溶液和单个细胞中,辐射光强度的检测比Ca2+浓度的标定容易。将脱辅基水母发光蛋白基因转移到一个烟草品种(Nicotianiaplarmbaginflia)中,转化幼苗在含有coelenterazine的培养基培养时,可以发光(Knight1992)。因此通过测定发光的强弱,就可测得[Ca2+]i。水母蛋白可在不同细胞区域、不同组织、或不同植物的发育阶段表达,从而提供一个测定胞内Ca2+浓度的有效方法。2aba的合成水分亏缺条件下,植物根细胞可合成大量的ABA,并通过蒸腾流运送到叶片细胞质外体。由于植物质外体中pH的变化,ABA在植物体中可重新分布,即在酸性条件下,ABA可以质子结合形式从质外体通过质膜进入共质体,同时叶片保卫细胞本身也可能合成ABA,进而通过一系列代谢过程降低气孔的开度以减少水分的散失。ABA作为一种逆境信号分子对气孔运动的调节已得到普遍共识,Assmann(1993)提出了一个较为完善的气孔保卫细胞信号转导的模式,其中列举了人们已取得共识的信号成分和转导途径,除此之外是否还存在其他新的信号成分及转导途径,仍是人们不断探索的问题。下面我们根据相关文献并结合我们最近的研究工作着重就ABA受体、有关的第二信使、蛋白质磷酸化和离子通道的调节等几方面作一概述。2.1胞外ph对aba诱导的气孔开度的影响ABA在保卫细胞上不仅有胞外作用位点,也有胞内作用位点(Assmann1994)。Anderson等(1994)把ABA注射到鸭跖草单个保卫细胞胞质内,发现ABA对气孔的开度没有任何影响,在pH6.5下外用ABA,气孔开度被抑制达98%,这提示ABA对气孔的影响需胞外位点的参与。但在pH8.0下鸭跖草保卫细胞外用ABA,只有57%的气孔开度受抑制。Schwartz等(1994)发现,在胞外pH8.0且ABA浓度已达到通常引起气孔关闭的1μmol/L时,气孔仍然处于开放状态,向保卫细胞里注射ABA则会使之关闭。可见气孔内部的感应ABA的作用位点也起重要作用。事实上,胞外pH的变化会对ABA的存在形式产生影响,碱性条件不利于ABA跨膜进入胞质,而酸性条件利于ABA跨膜进入胞质。MacRobbie(1995)发现,把胞外pH由6升至8时对气孔开度的影响类似于降低胞外ABA浓度对气孔开度的影响。我们最近的研究也表明,胞内胞外应用ABA1μmol/L均可诱导保卫细胞产生H2O2,并且这种效应可直接诱导气孔关闭(张骁等2001,Zhang等2001c)。目前,ABA受体的克隆已成为研究植物细胞信号转导的重要目标之一。ABA受体的研究是从ABA结合蛋白入手的。受体蛋白与其激素分子之间应有很强的亲和力,然而和激素有强的亲和力的蛋白质却并非均是受体,如激素的运输蛋白和代谢酶与激素分子都有很强的亲和力,但均非受体。激素受体的一个重要特征是激素分子和受体结合后使受体激活,激活了的受体可引起特定的生理反应。相对于其他激素受体来说,ABA受体的研究比较落后。尽管近年来人们对ABA结合蛋白做了不少研究,也已得到了纯化的结合蛋白,但真正符合受体要求并表现生理功能的结合蛋白尚未见报告(杨洪强等2001)。值得欣慰的是,非洲爪蟾卵母细胞由于其细胞体积较大便于显微操作且细胞本身具有大量的、能表达所注射基因的各种组分(如聚合酶Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ等),过去常作为良好的模式表达系统用于克隆与动物细胞相关的受体基因,现在该模式表达系统已被成功地应用于鉴定ABA受体和研究相关的信号转导机制(Leyman等1999,Sutton等2000)。最近,从烟草cDNA文库中已分离出一种与人和酵母突触融合蛋白同源的Nt-Syr1基因。该基因在卵母细胞表达后所引起的细胞反应与ABA作用类似,即可激活Cl-离子流、质膜外向K+离子流和抑制质膜内向K+离子流(Leyman等1999),暗示突触融合蛋白可能参与了保卫细胞ABA信号转导,同时也表明利用卵母细胞这一研究系统可能有助于加深人们对保卫细胞ABA受体及其相关信号转导机制的认识。2.2胞内贮钙体的ca2+释放通道与气孔关闭Ca2+是重要的第二信使(Webb等2001)。Mansfield等(1990)报告胞外Ca2+可激活依赖Ca2+的磷酸酯酶,钝化K+内流通道,从而阻挡了使气孔张开所需要的K+离子内流,抑制气孔张开。此外胞内Ca2+升高可能激活依赖Ca2+/CaM复合物的蛋白激酶,从而激活膜电位控制的S型(slow-type)阴离子通道,使气孔关闭(Cousson等1995)。Gilroy等(1990)向鸭跖草保卫细胞注射结合态Ca2+(cagedCa2+),若以紫光照射,游离态Ca2+即进入胞液中,于是气孔关闭。他们还发现,即使在Ca2+通道阻断剂La3+存在的情况下,提高胞内IP3的水平,仍然能增加胞内[Ca2+]i,引起气孔关闭(Gilroy等1991),所以经IP3诱导而释放的Ca2+可能来源于胞内贮钙体,如液泡等。目前在液泡膜上已鉴定出3种类型的Ca2+敏感通道(Assmann1993):(1)液泡膜电位控制的使Ca2+内流整流电阈通道(inward-rectifyingvoltagegatedchannels);(2)IP3控制的Ca2+释放通道;(3)Ca2+外流通道。此外Ca2+也能通过质膜上Ca2+通道从胞外进入胞内(后面详述)。一般认为,胞内Ca2+积累,可调节阴离子的跨膜流出或刺激液泡内离子(如K+)的释放,最终导致气孔关闭。诸多研究表明,保卫细胞内Ca2+浓度呈现忽高忽低的振荡(oscillation)现象,而这种变化对气孔关闭可能是必需的(Schroeder和Hagiwara1990,McAinsh等1995)。另外,导致气孔关闭的4种刺激因子(ABA、活性氧、低温、外源Ca2+)均可对野生型拟南芥保卫细胞诱导出[Ca2+]i振荡(Staxen等1999,Allen等2000)。然而,对拟南芥V-ATPase突变体(det3)而言,尽管活性氧和外源Ca2+可持续增加[Ca2+]i(非振荡形式),但并不能诱导气孔关闭;只有能够诱导胞内[Ca2+]i振荡的ABA和低温才可诱导保卫细胞的正常关闭。这些结果表明[Ca2+]i振荡发生可能是气孔关闭的重要上游信号。然而,使[Ca2+]i增加并不是使气孔关闭的唯一途径。Allan等(1994)指出引起气孔关闭有不依赖Ca2+途径。ABA刺激引起胞内pH增高,增加外向K+离子流,此过程中不出现Ca2+的升高。Irving等(1992)还发现[Ca2+]i的升高有时也能引起气孔的张开。Ca2+信使作用的多样性,可能是因为Ca2+的水平以振荡形式增加,在不同时间里[Ca2+]i的空间分布不同所致。最近有些工作已证实,环腺苷酸二磷酸核糖(cADPR,cyclicADP-ribose)(Wu等1997,Leckie等1998)、磷酸酯酶C(phospholipaseC)(Staxen等1999)和磷酸酯酶D(phospholipaseD)(Jacob等1999)可通过提高细胞[Ca2+]i来抑制质膜K+内流通道、激活质膜K+外流通道,从而参与ABA的信号转导过程。2.3aba对气孔的调节活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)作为植物“第二信使”,已成为逆境生物学研究领域的一个重大理论课题,尤其对H2O2作为信号分子在植物-病原菌及动物-病原菌相互作用过程中的研究已取得了一些进展。目前愈来愈多的研究表明,H2O2作为信号分子参与气孔保卫细胞运动的调节,其调节过程与ABA对气孔的调节有许多类似之处,如胞内Ca2+浓度的升高(McAinsh等1996,Allen等2000,Pei等2000)、质膜内向K+通道的抑制和质膜外向K+通道的促进(MacRobbie1998,安国勇等2000)以及胞质碱化(Zhang等2001a)等。最近的工作还表明,H2O2可作为一个正调节因子参与ABA对气孔运动的调节过程(Pei等2000,苗雨晨等2000,Schroeder等2001,Zhang等2001b,c)。通过研究而了解H2O2在气孔保卫细胞ABA信号转导中所起的作用可能有较大的理论价值。2.4磷酸酶激活的信号通路队伍离子通道大量研究表明蛋白激酶/蛋白磷酸酶(PK/PP)在保卫细胞ABA信号转导中起重要作用(Armstrong等1995,Schmidt等1995,Pei等1997,1998,Li等2000,Schroeder等2001)。PK/PP系统可通过调节质膜H+-ATPase的活性,影响跨膜极化状况而影响保卫细胞的跨膜离子运转(Shimazaki等1992),同时也可通过使离子通道蛋白磷酸化/脱磷酸化直接影响离子通道的运转活性(Armstrong等1995),最终影响气孔的运动。目前,已知参与气孔保卫细胞信号转导的蛋白磷酸酶主要有PP1、PP2A和PP2C等。其中PP1、PP2A可被冈田酸(okadaicacid)所抑制,且不需要二价阳离子所激活;PP2C可被低浓度的冈田酸所抑制,它不需要Ca2+而需要Mg2+所激活(Smith和Walker1996)。已有证据表明,所有这些类型的蛋白磷酸酶均参与保卫细胞离子通道的调节(栾升1998)。其调节机制可能是直接使通道蛋白脱磷酸化而影响离子通道,或通过调节离子通道活性元件而调节离子通道的活性。值得提到的是,PP1/PP2A在不同的植物中可表现出不同甚至相反的调节效应,如在拟南芥中,PP1/PP2A起着加强阴离子外流的调节作用参与ABA对气孔运动的调节,因而是正调控因子(positiveregulators)(Pei等1997);而在蚕豆、鸭跖草等,PP1/PP2A起着减弱阴离子外流的调节作用参与ABA对气孔运动的调节,因而是负调控因子(negativeregulators)(Schmidt等1995,Grabov等1997)。除蛋白磷酸酶外,目前在保卫细胞中已初步证实某些蛋白激酶也作为正调节因子参与了保卫细胞ABA信号转导过程(Knetsch等1996,Sheen1996,Li等2000)。其中一类是依赖Ca2+的蛋白激酶(Ca2+-dependentproteinkinases,简称CDPKs),该激酶可使K+内流通道KAT1基因编码的蛋白质磷酸化,从而钝化K+内流通道(Sheen1996,Mori和Muto1997,Li等1998);另一类是不依赖Ca2+的蛋白激酶,其分子量为48000。目前已从保卫细胞中分离出一种能被ABA激活的Ser/Thr蛋白激酶(ABA-activatedserine-threonineproteinkinase,简称AAPK),此酶在ABA激活S型阴离子通道导致气孔关闭过程中起重要作用(Li等2000)。2.5拉伸激活通道scraft电生理研究表明,气孔保卫细胞质膜和液胞膜上存在许多离子通道(MacRobbie1998,Assmann和Shimazaki1999,Schroeder等2001),其中研究较多的是质膜上的离子通道。ABA可使质膜去极化。目前在保卫细胞中已鉴定出3种类型的阴离子通道。第1种类型是受生长素调节的R型(rapid-type)阴离子通道。该通道在膜去极化时可迅速被激活,在膜超极化时又可迅速失活,当膜电位处于-100～+30mV范围内,此通道仍处于活性状态,并且在-30～-50mV处有最大电流(Schroeder和Keller1992)。第2种通道是S型(slow-type)阴离子通道的,可被ABA激活,其激活所需膜电位范围较宽(-200～+60mV),在0mV处出现最大电流。但S型阴离子通道的激活和失活都很慢(Schroeder和Hagiwara1989,Schroeder和Keller1992)。第3种类型的阴离子通道——拉伸激活(stretch-activated)通道,该通道对Cl-有高度的选择性。药理学的研究发现,R型和S型阴离子通道的抑制剂NPPB(5-nitro-2,3-phenylpropyll-aminobenzoicacid)可以完全抑制ABA和苹果酸诱导的气孔关闭,而R型阴离子通道的抑制剂DIDS(4,4′-disothiocyanatos-tilbene-2,2′-disolfonicacid)不能抑制S型阴离子通道,对ABA和苹果酸诱导的气孔关闭没有明显作用(Schroeder等1993),提示S型阴离子通道在ABA诱导的气孔关闭过程中起主要的调节作用。最新的研究表明,G蛋白和AAPK激酶在ABA激活阴离子通道、抑制气孔开放过程中起重要作用(Li等2000,Wang等2001)。除此之外,保卫细胞质膜上还有2种类型的K+通道,即内向整流K+通道(inward-rectifyingK+channels)或简称K+内流通道,膜的超极化可激活此通道,导致胞外K+的内流;外向整流K+通道(outward-rectifyingK+channels)或简称K+外流通道,可被膜的去极化所激活。ABA可通过诱导质膜的去极化而激活外向整流K+通道、抑制质膜内向整流K+通道,导致胞内K+外流,气孔关闭(MacRobbie1998)。另外,保卫细胞质膜上Ca2+内流通道