人类脊髓损伤模型的研究进展

人类脊髓损伤模型的研究进展

近年来，随着骨髓损伤（cp）发生率的增加，人类对疾病的认识不断深入，并在基础研究和临床治疗方面取得了一些进展。但由于疾病的复杂性和神经科学的特殊性,对于人类SCI的治疗研究至今尚未取得突破性的成果。复制人类SCI的动物模型是研究SCI后再生修复的重要方法,理想的SCI模型应具备以下3方面的条件:①临床相似性,即制作的SCI模型与临床相近;②可调控性,可根据实际需要调整损伤强度,复制出不同损伤程度的SCI模型;③可操作性和可重复性,即对SCI模型制作的各关键步骤客观化、定量化,使其可信度高、可实施性强,能反映客观问题。建立SCI动物模型有多种方法,不同的模型复制出不同类型的解剖结构损伤和神经功能改变,但任何一种模型都不能完全模拟临床SCI。目前常用的方法有挫伤、半横断损伤和全横断损伤等,每种模型各有其优缺点。Allen创立的重物坠落法已经沿用了很多年,并不断进行着改良。该法的主要优点是可以保持硬脊膜完整,有效地防止外源性成分侵入SCI区域,并防止脊髓外露和脑脊液外漏,复制出的模型与人类SCI的相关性较好,且与人类SCI的性质相似。但是,它与半横断损伤的共同缺点是无法很好地确定损伤区的新生轴突是由损伤的神经再生还是由残存的健康神经组织代偿侧枝发芽而形成。与之相对,脊髓完全横断损伤模型尽管也有一些缺点,如与临床SCI相关性较差、实验动物死亡率高、术后并发症较多、需要繁重的术后护理等,但相对于其他模型,该法可以准确地证明再生的轴突和确定最有效的治疗策略,能较好地证明再生的轴突与肢体功能恢复的因果关系。因此,该模型主要用于SCI修复、再生等方面的研究,最适合开展移植治疗实验。本文对建立大鼠脊髓全横断损伤模型的一些问题进行综述,讨论建立大鼠脊髓全横断损伤模型的具体方法、并发症及相应的处理措施及模型的评价问题,以期实现大鼠脊髓全横断损伤模型的标准化。1大脊柱横截面破坏模型的建立1.1影响sd大鼠特殊表现的因素大部分学者选用10~12周龄、体重为200~300g的Sprague-Dawley或Wistar大鼠进行研究。不同的研究中,选用单一性别的居多(多为雌性)。然而,这种单一性别的样本是否会影响SCI的研究结果?鉴于此,有学者研究了SD大鼠脊髓横断损伤术后死亡率和性别的关系,表明大鼠术后死亡率在性别上的差异无统计学意义,同时指出雌雄大鼠尿路解剖学特点的不同导致雌性大鼠在术后护理方面优于雄性大鼠。也有学者研究了脊髓全横断模型的性别影响,证实雄性大鼠的术后死亡率、压疮发生率明显高于雌性大鼠,但性别因素对大鼠脊髓全横断损伤后的病理变化及功能恢复无显著影响。还有学者也指出选择雌性大鼠作为研究对象的原因在于雄性大鼠死亡率较高。这些研究表明在SCI的研究中选择雌性大鼠进行实验的原因主要在于其并发症相对较少,便于术后护理。1.2手术入路的精确定位大多数研究选择的横断平面为T7~9节段。有学者论述了选择T9水平进行脊髓横断的原因:①胸段SCI临床最为常见。②损伤节段越高,轴突损伤距高位中枢的神经元胞体就越近,胞体坏死和凋亡的可能就越大。神经元胞体是细胞的营养中心,只有在胞体没有死亡的情况下才有纤维再生的可能,所以过高节段的SCI不利于上位中枢长传导束的再生。③高于中胸段的脊髓全横断损伤将对交感链产生影响,从而导致内脏功能失调,降低动物存活率。④T9平面以下涵盖了双侧后肢的功能范围,有利于评价功能恢复情况。然而,手术入路的精确定位有赖于对动物解剖标志的准确掌握。王增涛进行了Wistar大鼠全身骨骼的CT三维重建扫描,观察到大鼠脊椎序列定位的解剖学标志:肩胛骨后角平T5椎体,髋结节平L6椎体,坐骨结节平S1椎体,C2和T2高大,发现T9~11棘突连接紧密,可以作为背部定位的标志。1.3显微缝合线缝合行是否有必要保持硬膜的完整性尚无统一的要求,故在具体操作中也就存在不同的方法。有学者认为若能得到硬脊膜完整的SCI动物模型,可有效防止脑脊液外漏,减少结缔组织、组织间液或其他外源成分对SCI区的干扰。故有研究者在SCI后用11-0显微缝合线缝合硬脊膜和蛛网膜。这是一种可行的方法,硬膜的缝合可以使损伤区保持良好的微环境,减少外界因素对脊髓再生修复的干扰。但是,很多研究都是在脊膜外施行脊髓全横断操作,未提及脊膜的缝合问题,可能是由于硬膜的分离和缝合增加了手术操作的难度所致。这就对实验人员提出了更高的要求,需要以熟练的显微外科操作技术为基础,提高手术的精细程度。1.4特殊方法检测髓组织的横断性理想的大鼠脊髓全横断损伤模型就在于确保损伤部位的脊髓完全被切断,不同学者采用不同方式,可切断脊髓或者切除部分脊髓。有研究者使用显微剪切掉1.5mm脊髓组织,另有研究者使用探针穿过脊髓横断区,将脊髓残端轻轻挑起,都证实为完全横断。还有研究者使用虹膜剪水平切断脊髓并切除3mm,显微镜下确认无神经纤维相连。也有研究者为排除不完全性横断对实验的影响,利用剪刀在SCI区留2.0~3.0mm缺损,并以明胶海绵填塞。虽然没有一致的标准,但这些不同的方法都在于确认脊髓完全横断,无正常神经纤维残留,保证脊髓全横断损伤的可靠性。1.5面的腰椎旋转畸形有研究者发现,大鼠脊髓全横断术后的脊柱畸形多为脊柱后凸、后凸侧凸和旋转畸形;啮齿类动物行3个椎板切除术,它们多显示损伤平面的脊柱旋转畸形,因为是四足动物,通常没有其他畸形。很多的研究中都切除1或2个椎骨的棘突和椎板以及附着在其上的韧带,这样就势必造成脊柱的不稳定。故有学者采用在相邻椎体间放置自凝丙烯酸树脂制成的树脂桥来获得脊柱稳定的方法。也有学者指出通过椎旁肌肉的紧密缝合实现对脊柱的稳定,这种软固定方法操作简单,但固定效果不确切。尚未查到对大鼠SCI模型进行金属固定物内固定的报道。2术后并发症和一般对策2.1髓内横断后动物的生长高死亡率是脊髓全横断模型最严重的问题。大鼠脊髓全横断后如不采取有效护理措施,死亡率可达60%~70%,脊髓全横断后影响实验动物存活的主要因素有:①尿潴留;②泌尿系感染;③患肢受压水肿、褥疮。大鼠脊髓全横断后的死亡率主要与损伤的严重程度和术后护理的质量有关系,提高手术操作的精细程度,减少术中出血,加强实验动物术后护理可以降低术后死亡率。2.2确保了一般在饲养环境的温度全身麻醉、长时间的手术暴露、术中出血及体液的丢失引起血容量不足等都是导致实验动物术后低体温的原因,体温过低又可能进一步引起动物死亡。有研究者在术中使用加热垫使直肠温度保持在37℃±0.5℃;术后大鼠饲养在温暖环境中,室内温度保持在24℃±1℃,湿度为40%,取得良好效果。另外,术中精细操作以减少出血、提高手术熟练程度以缩短手术时间以及术后补液等都是减少此并发症的重要措施。2.3严格坚持培养“滥用”实验动物的感染主要是泌尿系感染和手术切口感染。因此,在动物实验过程中同样应该严格坚持无菌原则及术后应用抗生素预防感染等。在国内外的文献中抗生素的使用类型和剂量尚无统一的标准,在国内以使用青霉素和庆大霉素的较多,具体的用药剂量、给药途径也不一致。2.4损害脏器的需要大鼠脊髓全横断术后几乎都会发生尿潴留。尿滁留及其并发症是导致实验动物术后死亡的第1位原因,可占总死亡原因的50%以上。因此,人工挤压膀胱排尿便成为动物术后护理的重要内容。耐心轻柔是挤压膀胱排尿的基本原则。排空膀胱对避免尿潴留是极其重要的,尿潴留能引起膀胱壁的损害、出血,并因尿液回流导致肾脏损害;在大鼠自主排尿功能恢复前,人工排尿每日不得少于2次,慢性期也应该每日1次,每次排尿应使膀胱完全排空,因为残余尿液可能引起感染。2.5足踝水肿的预防大鼠脊髓全横断造成横断平面以下肢体完全瘫痪,如不采取措施,几乎无一例外地发生水肿,尤以足踝部为甚。水肿加之长期受压往往导致关节活动受限或变形,从而影响术后运动功能的恢复及评价。而肢体水肿时更易发生皮肤擦伤、破溃,这又成为局部及全身感染的诱因。陈杰等采用鼠尾悬吊的方法以克服这一并发症,效果较好。2.6压介绍发生率有学者研究了性别因素对大鼠脊髓全横断损伤后压疮发生率的影响,发现伤后6周雄鼠的压疮发生率为30%,雌鼠无压疮发生。雌性大鼠压疮发生率较低。有研究观察到大鼠尿道口周围皮肤有溃烂的现象,这主要是由于雄鼠尿液外渗导致局部皮肤受尿液的长时间浸渍所致,故通过对泌尿系统并发症的预防,保持垫料的清洁干燥、通风,进行肢体按摩和皮肤护理就可以有效预防此并发症。3慈姑动物模型的评价3.1多种评价方法的使用模型的有效性,即SCI动物的神经功能评定,主要有神经电生理评价、运动功能评价和组织形态学评价,应把三者结合起来确定SCI程度、观察恢复情况及评价疗效。评价运动功能的方法包括常用的Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)评分法、联合行为评分法、斜板实验法、爬网格实验法及Treadmill法等。这些方法方便实用、操作相对简单、应用广泛,但易受人为因素的干扰,使观察结果失真,在实际应用中应该注意克服主观因素的干扰,并联合使用多种方法,以弥补单一评价方法的不足之处。神经电生理评价方法比较客观可靠,尤其适用于动物SCI后运动和感觉反射不易直接观察的情况。组织形态学方法包括常规病理切片检查、轴突示踪、免疫组织化学检测及电镜检查等,都可提供干预措施有效性和神经轴突再生的客观证据,是比较可靠准确的评价方法,具体的检测项目取决于不同的实验方法和研究目的。在实际研究中,应该根据具体情况选择不同的评价方法,优化组合,提高动物模型的可信度和实验结果的可靠性。3.2术后运动功能恢复在很多研究中都观察到了大鼠脊髓全横断损伤后后肢不同程度的功能恢复,这可能归功于不同的治疗策略,但也有报道称未经治疗的脊髓全横断损伤大鼠出现了后肢运动功能的恢复,如何认定各种治疗策略和大鼠后肢运动功能恢复的因果关系呢?有研究者指出,在低等动物(包括猫、狗、鼠)中普遍存在着自发性后肢运动。基于此,相应的研究表明胸髓全切断后出现的后肢运动完全是自发性后肢运动恢复,这种完全的自发性后肢运动恢复可以达到并维持在BBB评分8分的水平。大鼠自愈能力很强。有学者认为,在观察到的脊髓完全性损伤时动物后肢运动功能的恢复现象是由于损伤不完全、残留下行纤维所致。对于正常神经组织的残留问题,有文献报告<5%的腹侧或外侧脊髓白质组织残留,大鼠的运动功能就可以完全恢复。有实验通过在原损伤平面(T9)以上及以下再次横断脊髓的研究表明脊髓完全横断后的后肢运动功能恢复是损伤远段脊髓的自主功能所致,而与损伤处是否有功能性修复或代偿无关。Steward等研究显示,在一些SCI的研究中,原先认为是神经再生的后来被证实是残留纤维,他们认