应用细胞表面抗体展示技术构建登革病毒特异性长链抗体库

应用细胞表面抗体展示技术构建登革病毒特异性长链抗体库

定海病毒（denv）属于黄毒科黄色病毒范畴，临床可导致定海热（df）、定海出血热（dhf）和定海休克综合征（sds）。由于全球气候变暖、国际旅游频繁和对蚊虫缺乏有效的控制,全世界有25亿人正受到感染登革病毒的威胁,是较为严重的公共卫生问题。由于其发病机制至今尚未清楚并且缺乏有效手段控制,近年来,登革热已成为继疟疾之后的最重要的热带病。近二十年来,抗体领域的发展使得人们能够应用现代的生物学技术克隆全套的人抗体基因组。噬菌体展示技术是目前发展最成熟应用最广泛的展示技术,此技术将单链抗体(scfv)或抗体的Fab片段展示在噬菌体表面,用于特异性抗体的分析和筛选。噬菌体展示技术受到广泛应用,但它表达的不是全长抗体而是抗体片段,所用的抗体表达系统是原核细胞,还有密码子的偏爱性、氨基酸修饰受宿主菌限制等局限性。哺乳动物细胞表面展示技术是新一代的抗体展示技术,可在表达抗体的哺乳动物细胞表面直接分析筛选高亲和力的全长抗体,优于常用的仅可用于筛选抗体片段的噬菌体展示技术;构建的哺乳动物细胞表面展示型全长抗体库的库容量达到1010。在本研究中,我们采用快速构建全长抗体库的方法,成功构建大容量的登革病毒特异性的抗体基因库,并应用流式细胞分析技术对抗体库的多样性及全长抗体在细胞表面的表达进行了初步分析,为筛选登革病毒特异性的抗体打下良好基础。1材料和方法1.1细胞转染剂和培养基哺乳动物细胞表达载体pDGB-HC-TM和pDGB-Hu-Kappa由本实验室构建。人淋巴细胞分离液购自天津美德太平洋科技有限公司。RNA提取试剂盒购自QIAGEN。引物均自行设计后由Invitrogen合成。限制性内切酶SfiI、BsmBI和T4DNA连接酶购自Fermentas,逆转录酶、TaqDNA聚合酶购自Promega。DH-5α感受态大肠杆菌购自Takara。质粒DNA小提试剂盒和DNA凝胶回收试剂盒购自Axygen。基础培养基(HanksF12、DMEM)和血清购自Hyclon。不含胰酶的细胞消化液(CellDissociationBuffer)购自Invitrogen。细胞转染试剂由杭州环捷科技有限公司提供。PE荧光标记的抗体购自BDPharmingen公司。外周血标本取自确诊的登革热患者。1.2方法1.2.1外周血淋巴细胞的分离登革热患者抗凝外周血约20ml,采用梯度离心法分离获得外周血淋巴细胞,加入裂解液,分装5管,-80℃冻存。取一管按试剂盒方法提取淋巴细胞总RNA2.4μg。1.2.2抗体igg重链可变区的pcr扩增用两步法扩增目的抗体基因。以1.2μg总RNA作为模板,以特异性的引物,用RT试剂盒逆转录为cDNA第一链;RT产物共25μl直接用于PCR扩增。参照贺微等的方法,用三套重链引物(HGP1,HGP2,HGP3)和三套轻链引物(HKP1,HKP2,HKP3),通过6个PCR反应,扩增抗体IgG重链可变区(VH)和kappa轻链(LCκ)基因库。PCR反应条件如下:94℃预变性5min;94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸1min,重复循环35次;最后72℃继续延伸7min。琼脂糖凝胶电泳回收目的DNA片段并测定其浓度。1.2.3抗凝胶电泳分离表达载体pDGB-HC-TM中抗体基因表达结构含有启动子及带有血小板衍生生长因子受体跨膜序列(plateletderivedgrowthfactorreceptortrans-membrane,PDGFR-TM)的人抗体全长IgG1重链基因(HC-TM)。用SfiⅠ酶切后可用于插入抗体全长的轻链基因,用BsmBⅠ酶切后可用于插入抗体重链的可变区基因。为构建抗体轻链基因库,用SfiI对载体pDGB-HC-TM和扩增获得的轻链基因进行酶切,进行DNA的凝胶电泳分离纯化,载体片段和轻链片段按1∶1分子比例混合,用T4DNA连接酶,在16℃连接24h,将连接产物用化学转化的方法导入化学感受态细菌DH5α,转化后的细菌接种于含有100mg/L氨苄青霉素的LB平皿,37℃培养过夜。根据长出的克隆数计算库容量,收集平皿上所有的菌落,即为抗体轻链基因库。为构建抗体重链基因库,用BsmBⅠ对载体pDGB-HC-TM和扩增获得的重链可变区基因进行酶切,并电泳分离纯化目的片段,然后进行连接转化,收集平皿上所有的菌落,即为抗体重链基因库。分别从重链抗体库、轻链抗体库中各随机挑选10个单克隆培养过夜后抽提质粒,测序分析抗体库的质量(广州Invitrogen公司)。1.2.4质粒转染法制备细胞转染在12孔细胞培养板中进行,每孔接种5×105CHO细胞,37℃培养过夜,然后进行细胞转染。取2μg质粒DNA(轻重链表达载体各1μg)和6μl转染试剂,分别用80μl基础培养基DMEM稀释,放置2min后将DNA溶液加入转染溶液,然后将二者的混合液在室温放置25min后直接加入细胞培养孔中;6~12h后换成新鲜培养液;48h后检测抗体在细胞表面的表达。1.2.5抗pa-pa-pe荧光标记体系的表达用不含胰酶的细胞消化液消化转染后的细胞,然后取分散的细胞与荧光标记的抗体进行反应。在50μl反应体系中含有5×105细胞和2μlPE荧光标记的鼠抗人Kappa链的特异性抗体(PE-Kappa),混匀后于冰上孵育30min,用染色缓冲液洗涤细胞1次,然后将细胞重悬于400μl的染色缓冲液,用流式细胞仪分析抗体基因在细胞表面的表达。用FCSExpressV3软件对结果进行分析。2结果2.1pcr扩增产物的分析以所获的外周血淋巴细胞总RNA为模板,经逆转录合成cDNA,然后以cDNA为模板,用特异性引物扩增出LCκ基因和VH基因。将PCR扩增得到的3组重链可变区(VH)产物和3组轻链(LCκ)基因产物,经琼脂糖凝胶电泳分析可见450的DNA条带和750的DNA条带,大小与预期结果相符(图1);回收相应大小的DNA片段,微量紫外分光光度计测定6组扩增产物的产量。重链HGP1-HGP3,分别为2255、2100、1700ng;轻链HKP1-HKP3,分别为2265、1870、1890ng。2.2检测dna片段的表达每组扩增产物各取700ng,将轻、重链基因分别混合各得2100ng,进行第2次琼脂糖凝胶电泳,回收相应大小的DNA片段,微量紫外分光光度计测定、计算回收量,重链可变区基因(VH)630ng,Kappa轻链基因(LCk)735ng(图2A)。将第2次回收的VH和LCκDNA片段分别用BsmBⅠ和SfiⅠ酶切,然后进行第3次琼脂糖凝胶电泳,分别回收各获得125ng(图2B)。2.3研究多态性轻链克隆的编码及序列酶切后的轻、重链PCR产物,插入载体pDGB-HC-TM,构建获得的轻链基因库库容量为1.45×104,无插入片段的背景克隆为1.4%;重链基因库库容量为1.8×105,无插入片段的背景克隆为0.5%。随机挑选20个单克隆(轻、重链基因库各10个)进行测序分析,结果表明,10个轻链克隆中有8个含有正确的阅读框架,编码8个不同的氨基酸序列(图3A);10个重链克隆中有7个含有正确的阅读框架,编码7个不同的氨基酸序列(图3B)。2.4体外共转dna在ndg-hukappa和pdgp-hukappa共转染将8个轻链克隆与经鉴定可以高效表达重链的载体pDGB-HC-TM共转染CHO细胞,同时将7个重链克隆分别与经鉴定可以高效表达轻链的载体pDGB-HuKappa共转染CHO细胞,然后用流式细胞仪检测分析共转DNA在CHO细胞表面表达抗体的情况。结果表明8个轻链克隆、7个重链克隆均可检测到抗体的表达(图4)。3抗体的纯化及表达登革病毒感染可引起登革热(DF)、登革出血热(DHF)和登革休克综合症(DSS)。DHF/DSS病情严重,致死率可高达5%。由于其感染机制较为复杂,目前尚无行之有效的临床针对性治疗,也缺乏有效的登革疫苗,难以有效控制与登革病毒相关疾病的蔓延。单克隆抗体因其高度均一、生物活性单一和与抗原结合的特异性强等优点,越来越受到重视,用于许多疾病的诊断和治疗。如能构建登革病毒特异性抗体库,筛选到针对登革病毒的高特异性人源抗体,对于探讨登革病毒的发病机理,用于研发针对登革热的临床药物,用于疫苗的研制,都是非常有意义的。作为达到这个目标的第一步,我们设计用登革热患者恢复期外周血淋巴细胞的RNA为原材料,构建登革病毒特异性抗体库。噬菌体表面抗体展示技术是目前常用的抗体筛选技术,但其所用的抗体库表达和筛选系统是原核细胞,其偏爱的密码子不同于哺乳动物细胞,也没有表达后修饰,表达的是抗体片段而非全长抗体。因此,即使筛选到抗体,后期的改造工作量大,成本高,成功率低。本课题应用的哺乳动物细胞表面抗体展示技术是在其他展示技术的基础上发展而来,直接用常用于抗体生产的CHO细胞作为表达筛选系统,所表达的抗体在分子结构、理化性质和生物学功能方面最接近于天然的高等生物蛋白质,能直接在细胞表面进行许多抗体特性如亲和力和表达强度等的分析,用于抗体药物的研发将可能降低成本,缩短时间,提高成功率。为了保障扩增的抗体基因库的质量,实验中,先后对PCR产物进行3次琼脂糖凝胶电泳分离纯化(见图1,2)。每次纯化均进一步提高了目的DNA的纯度。实验采用两步法分别进行RT和PCR反应,并在PCR反应时将反应体积扩大到100μl进行35次循环扩增,从而使PCR反应的每组产量至少达到1.4μg,确保多次纯化后仍有足够的产物用于基因库的构建。抗体库的大小及质量很大程度上受连接、转化效率的影响。本课题采用了BsmBⅠ和SfiⅠ这两种限制性内切酶制备载体片段和抗体基因片段,切割之后形成的末端并非回文结构,不能自我连接,只能在载体和插入基因之间才互补连接。在本研究中,我们分别构建了抗体轻链基因库和重链基因库。基因库中没有插入抗体基因的背景克隆仅为0.5%~1.4%,远远低于可以接受的10%的比例。当将轻重链抗体库共转染哺乳动物细胞时,细胞可以通过自身的天然配对形成全长展示型抗体表达在细胞表面,抗体库的理论库容量可以达到2.61×109。分别构建抗体轻链库和抗体重链库,不仅保证了抗体库的质量,也提高了操作的灵活性,研究者通过共转染表达全长抗体时,可以根据需要调整轻重链抗体库DNA的用量。如抗体基因序列(图3)和抗体表达(图4)分析结果所示,8/10的轻链克隆、7/10的重链克隆均可检测到抗体的表达。因此,本研究报道的抗体库,理论上可表达抗体的多样性可以达到1.46×109[(1.4