PC12细胞的培养整理总结

PC12细胞的培养整理总结一、PC12细胞的折光性本来就比较好，刚传代以及新分裂的细胞都是亮的，至于你说的贴壁的细胞，不知道是否是圆的，在牛血清的刺激下，特别是国产的，会使pc12细胞发生定向的分化，长突起，贴壁就比较牢。PC12分为未分化的和分化的.前者是球状,成团生长;后者形成很多丝状体;而丁香园里有人说楼主的这种细胞严格来讲已经不能算是PC12了.前几天为自己养的PC12是未分化还是分化型困扰,查了一些资料,现发上来希望能给有同样问题的战友有一点帮助!培养条件:ＰＣ12细胞培养于铺有鼠尾胶原的玻璃培养瓶中,置于ＣＯ2培养箱(37℃,95%空气5%ＣＯ2),培养基选用ＤＭＥＭ(ｐＨ7.4,高糖),加入10%灭活小牛血清及5%灭活马血清。分化前:ＰＣ12细胞在培养基中多呈圆形,直径15～20μｍ,也有椭圆或多角形的,扁平的细胞少见,倾向于聚集成小团簇状(A图)。分化后:加入ＮＧＦ后的24ｈ内细胞停止分裂,长出似交感神经元样的突起;第4～14ｄ,细胞体积增大,突起增多并增长,形成网络,数周后,突起可长达500～1000μｍ(B图)。NGF可促进PC12细胞向类似交感神经元样的形态分化,最终导致PC12细胞在生理、生化方面都具有神经元样的功能[12]。分化后的PC12细胞对ACh的敏感性增大5~7倍有的战友提到分化的PC12药敏性更好是不是因为分化后的PC12细胞对ACh的敏感性增大5~7倍二、我养这个细胞一年多了，有点经验和大家交流一下。1.我用的是15％的马血清和2.5%的胎牛，胎牛要用进口的，国产的容易分化。2.关于表面处理的问题，值得注意的是胶原和多聚赖氨酸使细胞贴壁的原理不太一样。多聚就是纯粹的物理黏附作用，而胶原则是刺激的细胞，使细胞的表达一些能有助于贴壁的蛋白，这种刺激作用还涉及到MAPK途径，所以如果做细胞信号转导的战友要注意到这点。相关的文献可以自己到pubmed上查找。3.完全分化的细胞不能传代，因为贴壁已经很牢固，强迫其脱离可能造成，尤其是细胞的突起断裂，细胞存活率很低。4.用NGF刺激的24－48h后，细胞可以消化下来传代或者冻存，用于继续培养。一般这种细胞叫做NGFactivatedcells。用于检测待测物的NGF样活性，指标是细胞突起的程度。5.楼上有照片贴出来细胞呈现梭形，严格讲这种细胞已经不能叫做PC12了。严肃的话最好放弃。6.该细胞容易聚集生长，传代种到新瓶子之前最好充分吹打，把细胞弄匀，否则传的细胞也呈现聚集的团，很难看。我的经验是消化液用EDTA加比较稀的胰酶，这样消化的细胞比较容易成单细胞悬液。三、我目前已经养PC12一个多月了，经验谈不上很多，不过失败的教训倒是不少，可以拿出来和大家分享一下1.细胞的培养基，我开始用10％FBS国产四季清的，DMEM，没加马血清和多聚赖氨酸什么的，因为条件关系，结果细胞贴壁性很好，生长速度还可以，3天1：2传代，在传到第5代时候，观察细胞状态下降，正常对照组也开始出现调亡，后查文献发现血清用多了，分析其内含有大量刺激生长物质，导致细胞出现分化，状态不稳定，目前改用5％FBS，DMEM，细胞生长速度明显放慢，现5天1：2传代，这和ATCC上PC12的倍增时间92小时比较接近。2.传代时候的细胞密度，有人说传代时候细胞过密，可能导致细胞分化，但是我在细胞仅50～60％传代，细胞死亡率很高，因此目前改用80％传代，还算稳定，确实有分化的迹象，如，细胞出现多角形等，但属轻度，和楼主说的差不多，可能和我用国内血清有关。3.胰酶对PC12无效。我个人提出胰酶消化PC12是个错误观点，其一针对悬浮PC12，胰酶消化的效果不好证实，其二，我养的PC12，性质贴壁，用100％胰酶消化1小时，愣是没动静，细胞甚至不变圆。最后用力拍打才可以，但代价是细胞损伤非常大，不好恢复。其三，ATCC上明确建议用细胞刮勺刮取PC12，目前我改用刮勺，细胞传代后状态要比用胰酶消化的好很多。4.再者关于1640和DMEM的问题，我个人观点，二者的主要区别在于DMEM含糖量高，神经细胞都喜欢这，另外1640含一些离子，是防止培养的细胞贴壁。1640一开始主要应用于单克隆抗体的制备，其后因其比较适合国内特点，比如价廉物美啊，所以目前在很多细胞上都有应用，ATCC上建议用1640，更多的原因是防止贴壁，诱导分化。不过，2种培养基我都试过，好像在国产5％血清的条件下，1640培养基不能改变PC12性状。所以我采用DMEM，能量高啊。5.因此我个人认为，5％的FBS，DMEM，足够PC12生长需要，4天左右1：2传代，可以不用贴壁处理（国产血清诱导轻度分化），如要求严格未分化，请参照ATCC推荐。四、ATCC上明确说PC12倍增时间为48小时。低分化:ＰＣ12细胞在培养基中多呈圆形,,也有椭圆或少量多角形的,扁平的细胞少见,倾向于聚集成小团簇状；高分化:细胞长出似神经元样的突起,培养一定时间后,细胞体积增大,突起增多并增长,可形成网络。细胞发生的分化的原因无非就是自发和诱发的，你这种情况诱发的可能性较大，我觉的是不是你的血清用的不当比如浓度偏高，再核对一下血清浓度，或者细胞接种密度太高、太低。由于血清中的各种生长因子和以及细胞代谢的自由基是最常见诱发细胞分化的因素。张均田主编的<神经药理学研究技术与方法>中提到:在培养液中加入NGF（50ng/ml），可促使PC12细胞分化正像上面的朋友们说的在培养液中加入NGF(50ng/ml)会使pc12分化而具有神经细胞的形态特征但要分化48小时以上才能看出来，表现为细胞体增大，有突触外伸。但需要注意的是分化后的细胞贴壁能力下降，因此在更换培养液时要小心，最好事先把培养皿用5ug/ml的poly-L-lysin处理一下，这样即使分化后也不易剥离了。还有就是NGF对玻璃的粘着性很强，在使用和保存时一定要用塑料容器。pc12在未分化时贴壁生长，但最好用5%HS,5%FBS/DMEM培养液，据说PC12在完全没有HS的培养液中贴壁不好。我用的是CORNING的培养皿，PC12贴壁很好。已经经过胶原蛋白处理的，因此贴壁很好。2.为何要自己处理成分化型的呢，上海脑所就有分化型的细胞株买。3.分化型的不用PLL处理的，但你如果不放心，可以用0.1mg/ml的PLL处理过夜就可以了。其实如果经费不足的话，国产的1%明胶同样处理过夜就可以了。PLL和明胶都用灭菌的去离子水配。分化的PC12细胞不用胰酶消化，未分化的才需要消化，就用0.25％的胰酶消化就可，消化时在显微镜下观察突起变短，胞体变圆时就直接用培养基终止消化。五、PC12细胞是大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤分化细胞株，具神经内分泌细胞的一般特征，因其具可传代特点，广泛应用于神经生理和神经药理学研究。关于这株细胞，血清的使用比例大家是怎么配的？看文献在马血清和胎牛血清的使用上很不同。大部分文献是10%马血清，5%胎牛。而ATCC更是15%马+2.5%胎牛1640和DMEM到底有多大区别？绝大部分人都用1640,也有小部分用DMEM,而ATCC是说用F12。我用的是1640。10%马血清，5%胎牛血清和双抗。pc12细胞分为分化的和没有分化的，只有分化了的PC12才具神经内分泌细胞的一般特征，广泛应用于神经生理和神经药理学研究。在一次性塑料培养皿上包被collagen或PLL都可以使分布均匀,贴壁良好,用我们公司的高结合力培养器皿和包被collagen相当或贴得更牢一些.其他实验我很少做,也就不清楚了.可以看看1976年GreeneLA关于PC12细胞建系的文章，PUBMED上有全文：我养的是高分化的pc12细胞，培养基用高糖DMEM+10%HS+5%FBS+双抗，消化用0.25％胰酶＋0.02％EDTA,挺好养的还在养细胞吗？事隔三年了。呵呵高分化了你当时也加了马血清吗？是的，还是要用10％的马血分化的:10%马血清+5%胎牛血清+1640(DMEM长的稍快)不分化的:10~15胎牛血清+1640(DMEM长的稍快)挺好养的,不能长得太满70%汇合就该传代了第二篇1.用NGF处理后，PC12细胞就会发生分化，所谓分化就是其长出突触，变成一种完全类似交感神经元的一种细胞模型。因为成为了神经元的细胞模型，所以这种发生分化的细胞是不具有增殖能力的。2.但是传说中的高分化的PC12的好像是一种细胞株，它类似于处在未分化PC12细胞跟NGF处理后发生分化的PC12之间的状态。它仍具有分离增殖的能力，性状长期保存。还是一种肿瘤细胞株。但是它在培养过程中贴壁生长，多边形而非圆形；未分化的PC12与之不同表现为悬浮生长，圆形。但是我到ATCC查了一下只有PC12的介绍，它所描述的PC12就是未分化的PC12，ATCC中并无高分化的PC12。而我周围同学包括园子里很多帖子讲到作试验所用的高分化的PC12细胞株是在上海典型培养物保藏中心买到的。我就不知道这个高分化的PC12是不是国内一种细胞株呢？我看的很多外文文献要么是用未分化的PC12，要么使用NGF诱导分化的PC12，但是从来没有见到过高分化的PC12细胞株。我不知道这个细胞株是不是国际公认的。细胞英文名称PC-12[PC12]细胞中文名大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞形态特性多角形生长特性疏松贴壁，有多细胞聚集体特征特性该细胞系来自可移植的雄性大鼠的肾上腺嗜铬细胞瘤；表达神经生长因子(NGF)受体，NGF可诱导该细胞产生可逆性的神经表型。该细胞可产生儿茶酚胺、多巴胺和去甲肾上腺素，但不合成肾上腺素。培养基RPMI1640(w/oHepes)血清5%FBS+10%HS其它因子无传代方法1:3传代；3~4天1次。传代情况C5冻存条件基础培养基+5%DMSO+20%FBS支原体检测阴性二、关于PC12的一点看法众所周知,PC12是大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞系,属神经嵴源性,具有神经细胞特性.由于具有分化型和未分化型两种形式,因此很多朋友包括我本人在内都困惑过做实验时应该选择哪种类型?根据最近查到的资料发现,无论分化型还是未分化型,都可以作为神经细胞来使用,分化型的PC12可以看待为成熟的神经元,因为无论形态还是生化特征都与神经细胞类似.而未分化型PC12可以看待为未成熟的神经元.值得注意的一个问题是,关于PC12培养液的使用,无论是DMEM还是1640,如果希望保持细胞的未分化状态,一定要添加马血清,用以封闭牛血清中可能促进其分化的某种成分,否则细胞就会渐渐分化.这种分化是一种不完全的分化,其形态并非像加入NGF之后那样完全分化.有人说这样的细胞不能用于实验,但是通过国内外很多文献发现,许多实验研究都是用没有添加马血清的PC12做的,因此个人观点也认为这样的细胞是可以用于实验的,可以看作是未成熟的神经元向成熟的神经元分化过程中的过度状态.总体来说,PC12的资料很多很多,是国际上公认的神经细胞模型.我本人做的是神经细胞毒性实验,因此选择未分化型细胞即可满足需要.当然也可以选择分化型,没什么不妥.注意PH值，微酸则代谢较慢，不能换液太勤。应该注意以下几点：细胞复苏一定要过关，培养液可以用10－20％的1640，但是最好用collegan或PLL报被板子；而没有必要用文献中的10H5F培养液！pc12细胞应该是很好养的，我养PC12从来没用PLL或collagen包被。你的问题应该主要是冻存的细胞有问题。三、关于细胞冻存问题还真不少。一年前我老板从美国带了五个不同的细胞株回来，其中有的公认很难伺候，但是本人硬是一次搞定，全部存活并冻存，之后的几个月中取出复苏活力均很好。谨将所得体会奉上，供参考。1.冻存时机应选择在细胞生长最旺盛时期，比如生长到培养皿80％。2.DMSO切不可为省钱而买便宜的，最好使用专用于cellculture的，如Sigma的3.要冻存前整个细胞室最好严格消毒一次。4.冻存的程序是：贴壁细胞消化，离心1000转10min，尽量弃去培养液，一滴一滴加血清，轻轻吹散，加含10％DMSO的培养基，封装冻存管5×10E6perml，置于－20C30min，放在密封的泡沫塑料盒中置-80C冰箱10～15小时，迅速置于液氮可长期保存。5.复苏时先准备好38C的水浴，从液氮取出后立即浸入水面，并轻轻摇动，最好在30sec内完全溶开，立即用10ml完全培养基洗涤离心一次以除去DMSO（我倾向于DMSO对某些细胞的复苏后生长有很大影响，因此这样比较保险）6.按正常状态种植细胞，血清浓度在首次复苏后的培养是可上调到15％。PC12细胞未分化型不需包被，PC12细胞用塑料培养瓶培养贴壁还可以，我传代时一般37度消化1分钟。不用包被，但是可能一开始要用塑料培养瓶培养，然后再转到玻璃瓶中，我的就是这样的。未分化的PC12细胞是悬浮生长的，传代的时候即使不吹打也可以收集。从协和细胞中心买来的未分化PC12细胞，最初培养时，是呈葡萄串样悬浮生长的，我个人感觉，传代时，稍微摇晃一下细胞瓶，再收集一半体积的细胞悬液，加入新鲜的培养液，吹打后接种到新瓶就可以了。不用离心，效果也是满好的。-------------------------------我也是刚刚开始培养这个细胞，一直也养的不是很好，但是却在园子里学到了很多的东西，下面是我从园子中的一些有经验的高手们中摘录的，不知道能不能帮到你，我现在的培养条件5％CO2，1640+10%FBS+5%HS培养基，另外如果一开始养不起来可以先用一次性培养瓶养，然后再慢慢转到玻璃瓶中。由于我也是用PC12细胞作实验，在实验中碰到的一些问题供大家借鉴：1.PC12细胞有两种：未分化型和分化型。其中未分化型的PC12细胞贴壁能力强，传代时需要胰酶消化，形状不规则。分化型PC12细胞传代时不需要胰酶，直接可以吹下来，形状规则。这两种细胞没有很大的区别，但我在实验中发现，未分化型的PC12细胞对药物的敏感性较之分化型的要差一些。2.由于PC12细胞是一种肿瘤细胞，在传代次数较多后，它的形状和性状会发生改变。这些改变尤见于未分化型PC12细胞。主要是细胞形状变得更加不规则，对药物的敏感性愈加下降。因此，建议长期用PC12细胞作实验的战友最好严格控制细胞的传代次数。在复苏细胞时动作一定要迅速，放入温水中1～2min后要马上加入培养液中，培养12～24小时后更换一次培养液，这样不仅可以把DMSO吸掉，而且可以将死亡的细胞也吸掉。细胞一天一看即可，经常动会有影响。注意过滤后血清的PH值，因为培养液过滤后PH值会有所改变。细胞生长不好，我认为有以下原因：1.有的细胞很脆弱，所以吹打时不要太用力；2.有的细胞对谷氨酰氨的依赖性较强，可考虑换新鲜的谷氨酰氨你用的营养液，血清浓度不知道是不是太高。血清浓度高的情况下，细胞容易老化，比较难长满，也难消化。建议降低血清浓度，我想8%-10%应该可以。由于神经元细胞需要极高的营养条件一般需要处理培养皿和培养瓶处理方法如下：蒸馏水溶解聚L-赖氨酸（10mg/l），过滤除菌，培养瓶内加入溶液，覆盖底壁即可；静置15分钟；去除溶液；加入培养液覆盖底壁，孵育2h，即可接种细胞！按照您的配方，您用的浓度应该是0.01mg/ml，比我刚才看的Midas主任推荐的0.02mg/ml还要低，我们实验室用的浓度是0.1mg/ml．而且我们使用时一般是要包被过夜的，我曾经着急用，就包被了两个小时，好像一点作用都没有．请问一下您用的是Poly-l-lysine还是Poly-D-lysine，我们用的是Poly-D-lysine.是Poly-l-lysine可以适当提高浓度或者加入胶原提高贴壁率----------------------------1.ATCC上指明：PC12的cultureconditions为RPMI1640+10%马血清＋5％胎牛血清，细胞形态为roundorpolygonal，在胶原酶coated的flask上为poorlyadhered！一周passagetwice！在nervegrowthfactor(50ng/mL)作用一周以后，停止分裂并且开始外生出processes，类似于sympatheticneurons，继续培养数周processes可以长达500~1000um。若去除NGF的作用，24h内processesdegenerate，72h内resumemultiply。passage达70代其生物学性质也无明显改变！（来自GreeneLA1976,73:2424-2428)2.不知楼主的flask用生长基质包被了没有，若无，PC12细胞既可呈悬浮生长又可呈贴壁生长！3.国产的胎牛血清从质量上至多达到国外小牛血清的水平，本人建议楼主换用进口的FBS。四、本人应用PC12作转染试验，培养液为DMEM（highglucose)+15%calfserum(Hyclone)，细胞生长比较理想！1.多聚赖氨酸一般用PBS或BSS配置成10倍质量的工作储存溶液（0.5mg/mL），使用时再稀释成工作浓度（0.05mg/mL），包被flask的过程如下：1）将工作浓度的多聚赖氨酸溶液加入到培养容器内，一般要求覆盖或湿润培养器皿的生长面即可，若要包被盖玻片，可将盖玻片直接置入盛有多聚赖氨酸工作液的容器内；2）包被时间为37℃静置2～4h或室温过夜（倾向于包被时间长些）；3）倾去多聚赖氨酸，消毒三纯水洗涤培养器皿数次；4）接种细胞前，培养液洗涤培养皿一次。2.我用DMEM（highglucose)原因是转染试验中细胞采用此培养液效率高些。3.现在有的reseacher应用的PC12在不加NGF的情况下也可外生出突起并且可以分裂，严格意义上说这种细胞已经不再是PC12了。养PC12的培养瓶或培养板一般不需要包被（除非细胞一直悬浮，则可用多聚赖氨酸包被2小时）；细胞接种之前小心轻吹打分散细胞，分散得越好越易贴壁生长；细胞接种后静置至少24小时以促进细胞贴壁，在此期间应尽量避免或减少观察次数；我也是从协和细胞中心购买的PC12细胞，买回后照上述相同的培养基培养（不过FBS是进口的），并注意了以上细节，一般在接种传代24小时后观察时细胞贴壁就很不错了。我们都是用DMEM高糖加10%马血清和5%胎牛血清，一直是贴壁的，长得很快，很好啊如果是高分化的PC12细胞培养基直接用高糖DMEM+10%FBS就行了，我最近正计划养这类细胞，查的资料也不少了，分化后的贴壁效果应该要比分化前的要低一些，不用胰酶，直接用移液器就可以吹下来。然后来回多吹几次，均匀分散就行了。五、我做的是PC12细胞。就我的经验给你点意见，供你参考。1.加入NGF诱导时需要加入血清，保证细胞的营养。我加的是5%胎牛和10%的马血清，分化的很好。2.突触的测量标准确实是有这样的问题。我认为，只要你能够找到相应的参考文献，能够拿出依据作为文章的证据，就可以。另外，如何测量突触长度的问题，我还没有解决，如果你有好的办法，希望我们能够交流。3.分化比率就是计数一定的细胞个数（文献报道数量不一，基本>200),计数的细胞里面有多少是长出达到长度的突触的，有多少是没有长出来的，算个百分率。【原创】PC12细胞1.细胞种类：大鼠嗜铬神经瘤细胞株;2.培养的天数：复苏后3d;3.放大倍速：倒置显微镜10X;4.培养基种类：RPMI1640+10%马血清+5%胎牛血清；5.细胞状态与特征简述:贴壁细胞，细胞形态呈圆形或锥形，胞浆伸展，胞间有突起互相连接。细胞折光性好，可见胞核，细胞状态稳定后生长速度快，成堆聚集生长。我现在也刚要做pc-12，查的资料显示pc-12未分化细胞具有更多的癌细胞特性；分化后有更多的神经细胞特性。另外我看到有些战友说直接去掉马血清可以诱导分化，这一点我表示怀疑，因为听说pc-12可以分化为不只一种细胞，未加NGF诱导的细胞分化的细胞应该并不是神经样细胞。所以我个人觉得必须得加NGF正像上面的朋友所说，pc12细胞只有在NGF诱导分化后才具有神经细胞的特征，才能被用于神经方面的实验。------------------------------------------------------------------------------------有关PC12细胞的相关研究PC12介绍：PC12细胞株源于大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤，是经辐射大鼠肾上腺髓质瘤而移植出的一种肿瘤细胞，经过连续单层培养获得。其胞体中含有大量嗜铬颗粒，富含多巴胺受体及合成，分解所需的各种酶类（包括TH，DG及MAO等）。PC12细胞上除有TrkB受体和P75LNTR外，还能表达两类钙通道：L型和N型，同时具有两类敏感型钙池：caffeine敏感型和IP敏感型。在无血清或低血清条件下培养PC12细胞，可导致其大量死亡，主要表现为凋亡。在有适当浓度神经生长因子（NGF）存在的条件下，其胞体可以生长出突起，类似神经元的轴突，分化成交感神经元样细胞，在形态，生理，及生化功能等方面更接近于神经元，被广泛应用于神经元死亡方式及毒性损害的研究。PC12细胞的培养一般PC12细胞接种在含5％胎牛血清，5～10％马血清，100U/ml青霉素，100ug/ml链霉素的DMEM培养基中（pH7.2），37℃，5%CO2温育。细胞接种后每2～3d换液1次，90％融合时转种到6孔培养板中，接种密度为5×105/ml，温育48h后作为实验细胞。我养的PC12是从上海细胞库买的分化型的，不需要包被就可以贴壁，而且细胞形态很好，增殖也很快，两天传代一次。pc12细胞分化是目前比较成熟的研究NGF对于神经元生长的模型。但是对于pc12细胞分化的指标判断一般是其突起长度大于胞体直径的二倍，作为判断标准，一般用胎牛和马血清培养时也会有很短的突起，但不能说此时细胞已经分化，可以登陆查看pc12是什么状态。1.是否经过NGF诱导后的pc12细胞才可做为神经元模型？答：对。2.细胞库有三种pc12细胞株，高分化低分化和未分化，他们的区别是什么？答：高分化的细胞突触更长，更接近神经元。3.有人说高分化的pc12细胞是长有突触的经过一段时间培养可以形成网状，那是不是比低分化和未分化更接近神经元？答：高分化的更接近神经元。4.高分化pc12是否具有分裂能力？答：对，高分化、低分化、未分化的pc12都具有分裂能力。5.高分化pc12是细胞株本身的性质？还是低分化或未分化经NGF诱导后形成的？答：是低分化或未分化经NGF诱导后形成的。哈哈，这个细胞我正在养，一开始养的也不好，不容易贴壁，现在可健康了^_^因为细胞是从其他lab拿来的，所以我用的条件不是atcc上说得那个，我用6％fbs和6％马血清加dmem养，全部都是Gibco的。培养条件试了很多，最后发现7。5％co2是最好的。你可以试试。当然5％也可以，但是长得慢，所以我最后选了7。5，一般3天subculture、。加马血清似乎是因为里面有某种fbs中没有的营养物质，总之一定要加！用trypsin后PC12会不健康，所以有二个办法。1。每次用完trypsin后1000rpm离心3min。将trypsin吸走。2。每次subcuture时候不用trypsin,和PBS，直接用medium把贴壁的细胞吹下来吹成单个的再长。我用的是后面一种，效果非常好。细胞很健康！PC12健康与否的判断方法（是我自己总结的）：没有加NGF时，如果细胞很健康，会长出很短的小轴突，整体圆圆的，很可爱。当它不健康时，你会发现，1，细胞不易贴壁了，会漂很多。2。细胞会呈现椭圆形，轴突变长（这时的细胞其实状态已经不好了，即使贴壁也不行！）用说得可能不清楚，我发张pc12的pic给你看。希望对你有所帮助^_^即使作分化好像也没有包被，虽然paper上说需要，但是因为cell状态好，所以就没作这。吹细胞的话，好像没有什么技巧。我就是用移液管吸medium对着底部反复吹。直到肉眼从反面看dish底部已经基本透明没有细胞就差不多了。好像细胞没有成团的现象呢。都是singlecell。用这种方法subculture的时候，建议用10cmdish养。flask的话吹打起来不方便，肯定不能吹打均匀。我也没有每次都换dish，一般是一礼拜换一次，但细胞状态不好的时候，每次subculture时都换新dish。细胞刚养的时候一定要多冻几管，万一不好也有back-up可以重新再来。还有一个办法就是常换medium、营养好，自然长得好。呵呵。都是很简单的方法，没什么绝招呢。他培养的PC12是用10％的胎牛血清，5％的马血清（invitrogen公司的），5％的co2，50ng/mlNGF刺激的时候没有盖盖子(怎么没有被污染呢？？)。我觉得有两点你要注意：1.细胞培养板的选择：一定要用进口的培养板，国产的大多贴不好。2.尽量使细胞处于良好的状态，包括培养液要新鲜配制备，注意PH值，提高牛血清的浓度。供参考。增加PLL的浓度，50－100ug/mg我用国产的NGF诱导过，效果可以，但只是做预实验，建议正式实验时，最好用进口纯化NGF，Promega公司有多种包装可选，价格相对便宜，效果也很好。建议不要用直接买的分化的PC12细胞，因为发文章时不会认可是神经细胞模型，而是变种的肿瘤细胞。PC12细胞还是很好养的，用DMEM高糖培养基，加10%胎牛血清就行了PC12主要有未分化、低分化和高分化三种类型，三种类型的PC12在分裂速度上差异不大，关键在营养要求上。未分化与低分化的PC12一般用DMEM+5%FBS+10%HS；高分化PC12只要用DMEM+10%FBS就可以。你的pc１２细胞繁殖速度超慢，平皿的汇合度仅有３０％，可能是因为PC12贴壁能力低，你的平皿应该用鼠尾胶原或多聚赖氨酸进行coating。养细胞不要急，实验前要计划好，好好分析原因！你先按照大家的意见做做看，我看了看大家的意见，对你应该很有帮助！未分化的PC12是很难养的，要注意包被培养瓶。你的培养基最好换换，可以多查文献啊，一般是高糖的DMEM+5％FBS+10%马血清（我的经验是Gibco的马血清贴壁最好）；马血清的功能是抑制PC12细胞形态的变化，有利于贴壁生长，不会抑制你用NGF诱导的PC12分化的；胎牛血清的作用是与细胞的增殖有关。PC12换液不要太勤！3到4天换液都行，并且最好保留一部分（如三分之一）旧培养基，有利于细胞的贴壁与增殖！！你传代时用胰酶消化吗？？有人说用0.025％的胰酶消化30秒就足够了，你可以试试，我没有用胰酶也行，为了让细胞不起团，我用了0.02％的EDTA帮助吹散细胞，但是也有点麻烦就是要离心一次。总之，养好PC12的关键在于马血清的选择（Gibco的最好）以及传代过程中对细胞的处理（吹打太多会影响细胞的贴壁，反之PC12会成团).希望对大家有帮助哈，欢迎大家发表自己的意见！！讨论有益啊！！！！！你还是不要太着急，你的细胞是刚复苏不久，它需要一段时间才正常的。我们开始的时候也是这样。但我们用的DMEM+马血清+牛血清，开始时也长得很慢，但过两个月后就开始长得很快，大概2～3天就要传代了。前一段时间因为我们的马血清都用完了，我们都没有给马血清，结果细胞还是长得很好，但是就有一些细胞出现低分化，所以马血清应该是有抑制分化的作用。还有PC12是不怎么贴壁，我们做MTT时要让它们贴壁都是用多聚赖氨酸进行包被。多聚赖氨酸分子量300000，储存浓度1mg/ml(用PBS液配制)。4度保存。用时稀释到50微克/毫升，加到包被的容器里，37度孵育过夜（我们一般都晚上做的），早上回收多聚赖氨酸，照紫外4小时后，再铺板。这样细胞贴壁效果较好。多聚赖氨酸一般用3～4次，就不要了！这是我个人的做法，不妥之处请各位多多指教！谢谢！希望大家试验顺顺利利！！！用赖氨酸包被培养板和培养瓶时，应该选用多聚左旋赖氨酸(分子量为15-30万)，我们用的是sigmaP7890,效果还不错。pc12细胞挺好贴壁的，不用包被即可。它有一个特性，在塑料瓶里贴的比在玻璃瓶里好，我们室里养pc12细胞都是在塑料瓶里养的，贴得很好。小旗小妹：PC12还是很好培养的，毕竟其本质是肿瘤细胞嘛，我的培养基用的是含10%BSA的PMRI1640，不用HSA。细胞状况很好PC12细胞的高分化型很好养，一般的条件即可，不需HS，培养器皿也不需铺胶。低分化型很难培养，我用5％HS＋10％FBS，在不铺胶的情况下，生长极其缓慢，传代后，生长状况更差，细胞死亡增加，细胞数逐渐减少。PC12本来就是贴壁不牢的细胞，会有很大一部分成球状，而且比较容易消化或者敲击就会掉下来。不过用赖氨酸包被后会好些，但是好像这种预包被的皿表面层会在三四天后逐渐脱落。另外聚团也是PC12的典型特征，很难分得特别均匀，即使吹打均匀了也会聚集生长。代传时间一长就会选择出贴壁好的亚型，成纤维细胞状的，不知道会不会影响你做实验。用未分化的还是分化的，还是要看你做的实验当中的重点是什么，如果你仅仅测存活或者凋亡率，而不牵扯到细胞形态的观察的话，那用未分化的和分化的都无大碍，但是感觉分化的比未分化的好养，但是要是你的实验中需要观察PC12细胞的一些形态特征，比如说需要扫描电镜观察突触数目及神经突触超微结构，以及免疫荧光检测细胞突触素和突触蛋白的表达，应该就用低分化或者高分化的，因为只有分化的PC12细胞才有神经细胞形态，才能表达突触蛋白，我也是刚开始养这个，不知道对不对，希望大家讨论，ngf大概需要诱导一周，常用50ng/ml.我们实验室PC12细胞养了几年拉，长的很好，不用马血清，DMEM+10%FCS就可以拉。细胞贴壁也可以，应该没问题。建议养此细胞用一次性培养瓶比较好包被后更好马血清要灭活将PC12细胞（2×104或2×105）接种于含10%胎牛血清、5%马血清，100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素的DMEM完全培养液（pH7.2）的塑料培养瓶（或培养皿）中。神经生长因子诱导PC12细胞分化神经纤维：要求：（1）细胞密度:2.5-10×104cell/cm2（2）塑料培养皿的包被。上述细胞培养24小时后，换入含2.5SNGF(50ng/ml)的DMEM完全培养液，以后隔天换液（含NGF）；取NGF分化5-10天后的PC12细胞用于实验。（一般情况下，NGF诱导10-14天时，NGF可使PC12细胞长出神经纤维，并形成致密的网络DMEM至少包含0.1%BSA之前做过未分化的，没有经过什么处理高分化，coning培养瓶，没有包被，感觉还可以。无需包被的，长的很好，很快有的细胞在高密度的情况下培养几天，因为细胞之间的相互作用可能细胞性状就会改变，个人觉得PC12可能也会有类似的改变吧（呵呵，没养过PC12，但养过P19，都可用于神经元分化的研究）。所以如果要用未分化的细胞做实验的话，传代要勤，保持细胞密度不要超过80％，还有传代次数多了就扔掉，重新复苏。pc12细胞可以被神经生长因子诱导分化成类神经元细胞，会长出轴突，和神经元细胞的结构和功能类似。未分化的可以用来做NGF的诱导实验等等，已分化的应该可以做神经元细胞相关的检测吧，像免疫组化什么的。培养用1640+10%FCS+5%HS,细胞生长很快，3天左右就要传一代，若要分化的话用NGF诱导分化，具体浓度说法不一，我用100ng/ml诱导成功过，会长出很长的轴突。关于胎牛血清和马血清的作用有人做过相关研究，指出马血清提供了PC12细胞神经样生长突触所需的重要因子，胎牛血清在PC12细胞培养中对细胞贴壁起着重要的作用，国际通用1640＋10％HS＋5％FCS培养pc12细胞，但我培养过程中觉得2种血清浓度对调一下生长更好，可能是细胞亚型不同吧。你要用马血清，牛血清会促进分化，而马血清会封闭牛血清作用的位点，从而保持细胞的未分化的状态。我用的是DMEM,10%HS,5%FBS。PC12细胞培养：10%HS,5%FBS，1640培养基（DMEM也可以，但是长的比较快）我们用的完全培养基是DMEM-F12不完全培养基85%+5%进口血清+10%马血清，培养瓶经过多聚赖氨酸包被分化时用含1%FB的1640S进行饥饿处理8小时，然后倒掉培养基，加入1%FBS，100ng/ml的NGF的1640培养，隔天2/3换液，诱导7天。不用加入HS，因为之前加马血清是为了覆盖细胞的分化位点，现在需要分化了，肯定不用HS，分化了细胞长的很慢，，长出很多很长的突起，易连成片分化的PC12细胞是很容易贴壁的,并呈现出神经元的形态特点,你应该先搞清楚是用分化的还是未分化的PC12;原代培养的神经元贴壁性差一些,所以要用多聚赖氨酸铺被,不容易贴壁不等于不能贴壁.pc12生长成cluster状，离心后吹打才能使细胞带分布均匀。我用1000rpm（eppendorff）5min，没有发现对cell有影响。不过，不同的离心机的rpm应该有不我的一点经验：1，复苏后第二天要换新的培养基，不然DMSo会在几代以后使细胞分化2，培养基中一定要加HS，10%，ATCC为15%，马血清有封闭PC12细胞分化位点的作用！3，冻存的时候应该按照ATCc的配方，即15%ＨＳ，２．５％ＦＢＳ，得高糖ＤＭＥＭ，加５％的ＤＭＳＯ来冻存，否则传数代后易分化！我养我养了几个月的pc12。不用分化时的培养条件：DMEMor1640+15%FBS需低程度分化时的培养条件：DMEMor1640+10%ES+5%FBS需高程度分化时的培养条件：DMEMor1640+NGF，没这样养过1.DMEM和1640养的细胞形态还不太一样（未加马血清）：1640养的细胞体积偏大，细胞成不规则多边形，而DMEM养的细胞稍小些，细胞尖角状多些（图一：1640养的）（图二：DMEM养的）2．加马血清后的细胞培养条件：DMEM+10%ES+5%FBS，传了4，5代，细胞长的较快，差不多24小时就传一次，开始细胞贴壁较好，用0.25%的胰酶可消化，细胞稍变圆就应该停止，一般1小时后大部分细胞就已经开始贴壁。消化时间过长，细胞不易贴壁。老化的细胞如此图有旋涡状。（图三：DMEM+ES）1640+ES（图四：分化程度稍高的PC12）养成图四那样的状态依然没有用多聚lys铺瓶，传代后细胞短时间内难贴壁，2天左右才慢慢长好，我觉得这可能是随着分化程度的增加，PC1