不同炮制方法对商陆中商陆皂苷甲含量的影响

不同炮制方法对商陆中商陆皂苷甲含量的影响

王燕2009127068中药制药河南中医学院摘要：目的建立商陆中商陆皂苷甲的含量测定方法，并考察不同炮制方法对商陆中商陆皂苷甲含量影响的差异。方法分别用醋炙法、醋蒸法、清蒸法、绿豆蒸法、高压蒸法炮制商陆,HPLC法测定不同炮制品中商陆皂苷甲含量，以SinoChromODSBP柱为分析柱，以1甲酸乙腈溶液和1甲酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，检测波长210nm,柱温30,流速1.0mL/min。结果商陆醋炙或清蒸1h后，商陆皂苷甲含量升高，醋蒸，清蒸10h,绿豆蒸，高压蒸后，商陆皂苷甲含量下降，尤以醋蒸品下降明显。结论所建立的商陆皂苷甲含量测定方法操作简便快速，结果准确可靠，但以商陆皂苷甲为指标来控制商陆饮片的质量较为单一，有必要进一步研究。关键词：商陆；商陆皂苷甲；炮制；高效液相商陆PhytolaccaacinosaRoxb始载于《五十二病方》，为传统的泻下逐水药，但生商陆毒性较大，多用于外敷痈疽肿毒，制后毒性降低,以逐水消肿为主，多用于水肿胀满。是故古今均极重视其炮制，《雷公炮炙论》记载：“每修事，先以铜刀刮去上皮了，薄切，架甑蒸，以豆叶一重了，与章陆一重，如斯蒸。从午至亥，出，仍去豆叶，暴干了,细到用。若无豆叶，只用豆代之”。［1］此后还有熬、炒黄、黑豆蒸、醋炙、醋蒸、酒制等。《中华人民共和国药典》2010年版以商陆科植物商陆PhytolaccaacinosaRoxb.或垂序商陆PhytolaccaamericanaL.的干燥根作为中药商陆入药。现今对于商陆中主要的毒性成分商陆皂苷甲的含量测定则有一定的研究，有薄层扫描法［2-3］、HPLCELSD法［4-5］等，但这些方法的准确性或重复性多较差。本文采用HPLC梯度洗脱，DAD检测一法，对商陆皂苷甲含量的测定进行了全面的方法学考察，并对醋炙、醋蒸、清蒸、绿豆蒸、高压蒸等不同炮制方法生产的商陆饮片中商陆皂苷甲含量的进行了考察，为商陆的质量控制提供实验依据，为探寻商陆的炮制机理打下了基础。1材料Agilent1100系列高效液相色谱仪，DAD检测器，Chemstationsystem工作站。商陆皂苷甲对照品（上海同田生物技术有限公司,E-0153)。生商陆饮片，为商陆科植物垂序商陆PhytolaccaamericanaL.的根。2方法2.1商陆皂苷甲含量测定2.1.1色谱条件SinoChromODSBP色谱柱(250mm4.6mm,5m),以1甲酸乙腈溶液为流动相A,1甲酸水溶液为流动相B,按表1进行梯度洗脱，流速1.0mL/min,检测波长210nm,柱温30,进样量20L,理论板数按商陆皂苷甲计不低于3000。表1商陆皂苷甲含量测定梯度洗脱条件时间/min流动相A/%流动相B/%0-435654-1535-4065-602.1.2供试品溶液的制备将生商陆饮片粉碎，过20日筛，取粉末约1g,精密称定，置25mL量瓶中，精密加入甲醇20mL，称定重量，超声处理40min,冷却后以甲醇补足重量，摇匀，过微孔滤膜(0.45m),取续滤液作为供试品溶液。2.1.3线性范围考察精密称取商陆皂苷甲对照品4.7mg,置10mL量瓶中，用甲醇溶液定容至10mL,配成0.47mg/mL的溶液。分别进样3、6、9、12、15L,以进样量为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，进行线性回归，2.1.4精密度实验取浓度为0.47g/mL对照品溶液，重复进样5次，测得峰面积,RSD为0.21%。2.1.5供试品溶液稳定性实验取同一供试品溶液，分别于0,1,2,4,6,8,12,24h进样，测得峰面积,。2.1.6重复性实验称取药材粗粉6份，按上述方法制备样品并测定含量2.1.7加样回收率实验精密称取生商陆饮片粗粉9份，每份0.5g,每3份一组，按样品中商陆皂苷甲含量的120%,100%,80%3个水平分别精密加入商陆皂苷甲对照品溶液，然后按供试品溶液制备方法制备。2.2不同商陆饮片的炮制1） 醋炙商陆：取生商陆饮片100g,加入30mL米醋，闷润30min,待醋被吸干后，置预热的炒锅中文火炒干。2） 醋蒸商陆：取生商陆饮片100g,加入30mL米醋，闷润30min,待醋被吸干后，置蒸锅中蒸1h,取出,70烘干。3） 清蒸商陆1:取生商陆饮片100g,置蒸锅中蒸1h,取出，70烘干。4） 清蒸商陆2:取生商陆饮片100g,置蒸锅中蒸10h,取出,70烘干。5） 绿豆蒸商陆：取生商陆饮片100g,加入100g绿豆，置蒸锅中蒸10h,取出，分离绿豆,70烘干。6） 高压蒸商陆：取生商陆饮片100g,置高压蒸汽灭菌锅中，以压力4kPa,温度121.3，蒸制30min后，取出，70烘干。2.3样品测定将不同炮制方法制得的商陆样品，分别按商陆皂苷甲含量测定方法测定，计算含量。3讨论1）商陆中含有多种三萜皂苷，结构变化较多，有加利果酸、熊果酸、熊果酸半乳糖苷、商陆皂苷、关商陆皂苷等20多种皂苷元和30多种皂苷。其中商陆皂苷甲具有特征性，含量较高，且《中华人民共和国药典》2010年版亦选择其为含量测定的指标，故选择测定饮片中商陆皂苷甲的含量来比较不同炮制方法对商陆的影响。样品溶液制备方法的考察根据商陆中所含皂苷类化合物的性质，选择了不同浓度的甲醇溶液为提取溶剂，其中20mL纯甲醇可以提取完全1g商陆粉末中的商陆皂苷甲，且杂质相对较少。由于商陆皂苷甲为齐墩果烷型五环三萜，只有末端吸收，故选择了210nm作为检测波长，同时采用乙腊水系统进行洗脱，可有效的避免杂质的干扰和基线漂移，加入甲酸后更可以有效改善峰形。2)《中华人民共和国药典》2010年版记载的商陆炮制法为醋炙法,同时历史上还出现过醋蒸、清蒸、绿豆蒸等方法，如《雷公炮炙论》中记载的即为绿豆蒸的炮制方法，并且在历史上沿用了较长的时间，故选择了醋炙、醋蒸、清蒸、绿豆蒸、高压蒸等不同方法炮制商陆，并对其中商陆皂苷甲含量的进行了考察。从实验结果可见醋炙和清蒸1h后的商陆中，商陆皂苷甲的含量有所上升，醋炙品尤为明显，升高达到26%;清蒸10h,绿豆蒸和高压蒸后的商陆中，商陆皂苷甲的含量有所下降；醋蒸后商陆皂苷甲的含量下降明显，下降了27%。推测原因醋炙和清蒸1h由于反应条件温和，可使商陆中含有的商陆皂苷庚等成分17位的酯键断裂，生成商陆皂苷甲，从而提高商陆皂苷甲的含量；而清蒸10h、绿豆蒸、高压蒸反应条件则较为激烈,加热时间长，不但会使17位的酯键断裂，还会导致部分商陆皂苷甲20位的酯键断裂，从而导致商陆皂苷甲含量有所下降;而醋蒸的方法加入了酸性成分，还使饮片较长时间处于高温高湿的条件下，大量的酯键断裂，很容易产生脱水、构型转变等反应，因此醋蒸商陆中商陆皂苷甲的含量最低。从临床使用情况来看，无论是醋炙商陆，还是绿豆蒸商陆都可以有效地减毒增效。由此可见商陆皂苷甲的含量与商陆的临床疗效并没有直接的关系，因此，以商陆皂苷甲为指标来控制商陆饮片的质量，值得的商榷，有必要进一步研究。参考文献：雷教.《雷公炮炙论》[M].上海：上海中医学院出版社,1986:104.王祝举，程明，原思通.薄层扫描法测定商陆饮片中商陆毒素含量[J].中国中药杂志，1990,15(9):27.范大均，安登魁，李修禄，等.双波长薄层扫描测定商陆及制剂中商陆皂