大肠杆菌感受态的制备课件

大肠杆菌感受态的制备大肠杆菌感受态的制备一、实验原理目前，感受态细胞的制备常用冰预冷的CaCl2处理细菌的方法制备，即用低渗CaCl2溶液在低温（0℃）时处理快速生长的细菌，从而获得感受态细菌。此时细菌膨胀成球形，外源DNA分子在此条件下易形成抗DNA酶的羟基－钙磷酸复合物粘附在细菌表面，通过热激作用促进细胞对DNA的吸收。在一定条件下，经过连接后的ＤＮＡ片段与感受态细胞混合保温，可以进入感受态细胞。进入感受态细胞的ＤＮＡ分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在选择性培养基中培养，即可筛选出转化体，即带有异源ＤＮＡ分子的受体细胞。二、实验所需器材和试剂器材：恒温摇床,电热恒温培养箱,台式高速离心机,无菌工作台,低温冰箱,恒温水浴锅,制冰机,分光光度计,微量移液枪。

试剂：1.LB固体和液体培养基。2.含特定抗生素的LB固体培养基。3.100mMCaCl2溶液。4.含15%甘油的0.05mol/LCaCl2:称取0.28gCaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,加入15ml甘油,定容至100ml,高压灭菌。5.待转化质粒。

三、实验步骤1.挑取一DH5α单菌落于5mlLB培养液中37℃过夜培养

2.取其中500ul菌液于一含50mlLB培养液的锥形瓶中，37℃振摇培养至OD600值达到0.5-0.6之间

3.取50ml菌液置于离心管内，4℃4500g离心5分钟4.加入30ml,100mM的冰冷CaCl2溶液，摇荡重悬细胞，冰浴30分钟5.4℃4500g离心5分钟收集细胞后，加2ml,100mM的冰冷CaCl2溶液轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。6.感受态细胞分装成200μl的小份,暂且不用的贮存于-70℃可保存半年。取其中一份进行转化。7.向转化管中加入DNA（不超过10ul）,轻度摇晃混合后于冰上放置30分钟。8.将上述混合物转移到预热到42℃的水浴锅中，热休克90秒(不要摇动试管)，然后将试管迅速转移到冰浴，冷却1－2分钟。9.向管内加入800ul的LB培养液。然后37℃培养45分钟。10.取适量体积的转化细胞转移到含有适当抗生素的LB固体平板上，用灭过菌的玻璃棒涂布均匀。室温放置几分钟11.倒置平板于37℃培养12－16个小时。四、实验注意事项为了提高转化效率,实验中要考虑以下几个重要因素：

1.细胞生长状态和密度:细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600来控制。2.质粒的质量和浓度:用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5％。3.试剂的质量:所用的试剂,如CaCl2等均需是最高纯度的(GR.或AR.),并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处。4.防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行。

五、本实验所需要掌握内容掌握大肠杆菌感受态的制备及转化的原理熟悉实验的具体操作步骤，掌握无菌操作技术。精品PPT课件浏览免费下载后可以编p:///jnejclxh/结石由无机盐或有机物组成。结石中正常有一核心，由脱落的上皮

结石细胞、细菌团块、寄生虫卵或虫体、粪块或异物组成，无机盐或有机物再层层沉积核心之上。由于受累器官的不同，结石形成的机理所含的成分、形状、质地、对机体的影响等均不相同。常见的结石有胆结石、膀胱结石、输尿管结石、胰导管结石、唾液腺导管结石、阑尾粪石、胃石、包皮石和牙石等。

尿石症是肾、输尿管、膀胱及尿道等部位结石的统称，是泌尿系统的常见疾病之一。泌尿系结石多数原发于肾脏和膀胱，输尿管结石往往继发于肾结石，尿道结石往往是膀胱内结石随尿流冲出时梗阻所致。肾、输尿管结石与膀胱、尿道结石比约为5.5～6∶1。尿石症的发生率男性高于女性，肾与输尿管结石多见于20～40岁的青壮年，约占70%左右；膀胱和尿道结石多发生在10岁以下的儿童和50岁以上的老年患者。尿石症引起尿路梗阻和感染后，对肾功能损害较大，尤以下尿路长期梗阻及孤立肾梗阻时，对全身影响更为严重，处理上也较复杂，严重者可危及生命。结石病是一种顽固性疾病，症状复杂，并发症多，易于残留一般口服消石胶囊每日4-6粒可以预防结石生成。///ht经临床观察发现，含钙结石是泌尿系结石中最常见的结石类型。约占全部泌尿

结石系结石的70%-80%。目前，仅有少数含钙结石病例能明确其病理病因，而大多数含钙结石的病因尚不十分清楚。按结石化学成分可分为含钙结石、感染结石、尿酸结石、胱氨酸结石四类。含钙结石可分为：单纯的草酸钙、草酸钙和磷酸钙、以及除草酸钙还有少量的尿酸；感染结石主要成分是磷酸镁铵和羟磷灰石；尿酸结石成分可分为：尿酸、尿酸胺或除上述成分外还含有少量的草酸钙；胱氨酸结石可分为：纯胱氨酸或含有少量草酸钙成分。编辑本段结石病因：正常尿内晶体饱和度和晶体聚合抑制因子的活性两者处于平衡状态，一旦由于某种因素破坏了这种平衡，不管是前者饱和度过高，或是后者活性降低，均可引起尿内晶体聚合，导致尿石形成。下列因素对尿石的成因有明显的诱发作用。全身性因素①新陈代谢紊乱②饮食与营养③长