细胞融合技术(共49张课件)

细胞融合技术第1页，共49页。

细胞工程是指应用细胞生物学和分子生物学的原理和方法，通过细胞水平或细胞器水平上的操作，按照人们的意愿来改变细胞内的遗传物质或获得细胞产品的一门综合科学技术。什么叫细胞工程？按操作对象分植物细胞工程动物细胞工程第2页，共49页。应用的原理和方法研究的水平研究的目的细胞生物学和分子生物学细胞水平或细胞器水平按照人们的意愿来改变细胞内的遗传物质或获得细胞产品概念：第3页，共49页。回忆：1、植物组织培养的大致过程包括哪几个阶段？离体的器官、组织或细胞脱分化（又叫去分化）愈伤组织再分化根、芽植物体2、植物组织培养技术的理论基础是什么？植物细胞具有全能性第4页，共49页。一.细胞融合技术概念：两个或两个以上的同种或异种细胞融合成为一个细胞的过程阅读课本第30-31页内容，回答问题：1.什么叫细胞融合技术？

2.常用的人工诱导细胞融合的方法有哪几种？哪一种重复性强，对原生质体伤害小，方法简单，可控性强？用人工方法诱导细胞融合，并在一定条件下使融合细胞分化再生，形成新物种或新品种的过程。物理法：离心、振动、电刺激（伤害小，可控性强）化学法：用聚乙二醇（ＰＥＧ）诱导灭活的病毒：仙台病毒、疱疹病毒等（适合动物）第5页，共49页。动物细胞融合（细胞杂交）－2个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程细胞A细胞B杂种细胞灭活的病毒物理法化学法仙台病毒疱疹病毒新城鸡瘟病毒离心振动电激聚乙二醇融合后形成的单核细胞称为杂交细胞第6页，共49页。用灭活的病毒诱导动物细胞融合过程细胞核病毒颗粒细胞核第7页，共49页。灭活病毒诱导细胞融合的原理：病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。灭活是指用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但并不破坏这些病原体的抗原结构。第8页，共49页。细胞电融合仪第9页，共49页。第10页，共49页。二、、植物体细胞杂交技术与作物育种因为不同种生物之间存在着生殖隔离，所以用传统的有性杂交方法是不可能做到这一点的。于是，这些科学家试图用这两种植物的体细胞进行杂交，来实现这一美妙的设想。这幅番茄—马铃薯图利用传统有性杂交方法能实现吗？为什么？“Potamato”第11页，共49页。1．你认为两个来自不同植物的体细胞完成融合，遇到的第一个障碍是什么？2．有没有一种温和的去壁方法呢？3．为什么两个原生质体能发生融合，这与细胞膜的什么特性有关？4、把原生质体放在一起能自然融合吗？5．如果两个来源不同的原生质体发生了融合，下一步该做何处理？6．如何将杂种细胞培育成杂种植株？请思考：第12页，共49页。植物体细胞杂交与动物细胞融合的比较容易产生各种变异B．具有更强的全能性AB、Ab、aB、ab知识能力化用这种方法获得的抗体，不仅产量低，而且抗体的特异性差，纯度低，反应不够灵敏。4、图中B为________过程，常用_________作为诱导剂，该细胞继承___________的遗传特性，既能__________,又能___________。获得白菜­甘蓝等杂种植物由于天然EPO来源极为有限，目前临床上使用的红细胞生成素主要来自于基因工程技术生产的重组人红细胞生成素(rhEPO)，其简要生产流程如右图。与传统制备的抗体相比具有什么特点？（导向作用，作为载体，生物导弹=单克隆抗体+药物，治疗肿瘤）细胞膜的流动性;细胞增殖6、为什么要用灭活的病毒？下列关于植物组织培养的叙述中，错误的是（）这幅番茄—马铃薯图利用传统有性杂交方法能实现吗？为什么？4、动物细胞融合能利用上述两类方法吗？还有其他方法吗？杂交的两个细胞用纤维素酶、果胶酶处理细胞壁原生质体Ａ、Ｂ经离心、振动、电刺激用聚乙二醇（ＰＥＧ）诱导融合后的原生质体再生细胞壁杂种细胞脱分化细胞分裂愈伤组织杂种植株再分化（植物体细胞融合完成的标志）植物细胞融合植物组织培养第13页，共49页。白菜甘蓝白菜－甘蓝“白菜－甘蓝”同普通白菜相比，具有生长期短、耐热性强和易于贮藏等优点。第14页，共49页。植物体细胞杂交意义？p33细胞融合技术可以避免受精过程，在亲缘关系较远的物种间实现基因转移，创造出自然界没有的新物种。

未解决的问题：

未能让杂种植物按照人们的需要

表现出亲代的优良。第15页，共49页。为什么“番茄—马铃薯”超级杂种植株没有如科学家所想像的那样，地上长番茄、地下结马铃薯？主要原因是：生物基因的表达不是孤立的，它们之间是相互调控、相互影响的，所以马铃薯—番茄杂交植株的细胞中虽然具备两个物种的遗传物质，但这些遗传物质的表达受到相互干扰，不能再像马铃薯或番茄植株中的遗传物质一样有序表达，杂交植株不能地上长番茄、地下结马铃薯就是很自然的了。

第16页，共49页。D．动物细胞培养可用于检测有毒物质和获得大量自身健康细胞A．培养基中添加蔗糖的目的是提供营养和调节渗透压动物胚胎或幼龄动物的器官或组织（二）、单克隆抗体的制备过程５、动物细胞融合与植物原生质体融合的基本原理是否相同？A．培养液通常含有葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等但极少数细胞可以连续增殖，其中有些细胞会因遗传物质发生改变而变成______细胞，该种细胞的黏着性______，细胞膜表面蛋白质（糖蛋白）的量________。1、如何获得化学性质单一、特异性强的抗体？骨髓瘤细胞---骨髓瘤细胞细胞膜的流动性;植物细胞全能性(3)如果[4]是无病毒植株，则水稻的细胞应选用_________或________细胞。(2)②过程可用聚乙二醇(PEG)，其目的是______________________。获得白菜­甘蓝等杂种植物用这种方法获得的抗体，不仅产量低，而且抗体的特异性差，纯度低，反应不够灵敏。分开不同杂交细胞，克隆专一抗体，检验阳性细胞细胞生物学和分子生物学抗体是由何种细胞产生的？2.抗体是如何产生的？？三.动物细胞融合与单克隆抗体第17页，共49页。读下面一段文字资料，思考以下问题：长期以来，为了获得抗体，采用的是把某种抗原反复注射到动物体内，然后从动物血清中分离出所需抗体的方法。用这种方法获得的抗体，不仅产量低，而且抗体的特异性差，纯度低，反应不够灵敏。人们发现，在动物发生免疫反应的过程中，体内的B细胞可以产生多达百万种以上的特异性抗体，但是每个B细胞只分泌一种化学性质单一、特异性强的抗体。要想获得大量的单一抗体，必须用单个B细胞进行无性繁殖，即克隆。第18页，共49页。

1、请从以上文字资料中找出单克隆抗体的概念2、怎样才能获得单克隆抗体？提示1：仅用细胞培养技术可行吗？提示2：我们所学的哪种细胞是可以无限增殖的？提示3：有什么方法能使B细胞产生抗体的能力和肿瘤细胞无限增殖能力同时具备呢？用单个B细胞进行克隆，得到的细胞群能够分泌一种化学性质单一、特异性强的抗体，这种抗体就叫做单克隆抗体。（一）单克隆抗体概念第19页，共49页。1、如何获得化学性质单一、特异性强的抗体？单克隆抗体问题讨论提示：1.什么样的细胞可以产生抗体？2.什么样的细胞可以无限增殖？2、瘤细胞和癌细胞有何区别？共同点：两者都有无限增殖的能力不同点：瘤细胞不能转移第20页，共49页。

设计方案：一个B淋巴细胞－－只分泌一种特异性抗体小鼠骨髓瘤细胞－－能无限增殖杂种细胞单克隆抗体第21页，共49页。实验目的:制备单克隆抗体.实验原理：B淋巴细胞能产生抗体，骨髓瘤细胞能无限增殖，杂交瘤细胞既能产生抗体又能无限增殖。实验材料：小白鼠实验器材：培养皿、针筒等等。实验过程：如下页根据阿根廷科学家米尔斯坦和德国科学家柯勒设计的实验方案:第22页，共49页。B淋巴细胞注射特定抗原蛋白骨髓瘤细胞培养骨髓瘤细胞融合（只考虑两两融合）培养液中细胞有几种类型？融合细胞几种类型？骨髓瘤细胞---骨髓瘤细胞B淋巴细胞---B淋巴细胞B淋巴细胞---骨髓瘤细胞多种杂交细胞在具有筛选作用的培养基上培养专一抗体检验阳性克隆上述杂交细胞分开不同杂交细胞，克隆专一抗体，检验阳性细胞单克隆抗体注射到小鼠体内体外培养（二）、单克隆抗体的制备过程第1次筛选目的：得到杂交瘤细胞（多种）。第2次筛选目的：在杂交瘤细胞中筛选出能产生所需抗体的杂交瘤细胞。该细胞继承双亲细胞的遗传特性，既能产生专一抗体又能无限增殖。杂交瘤细胞有何特点？特异性强，灵敏度高第23页，共49页。腹腔注射法第24页，共49页。免疫小鼠培养骨髓瘤细胞融合骨髓瘤细胞B淋巴细胞注射特定抗原蛋白选择培养基上培养专一抗体检验阳性专一抗体检验阳性注射到小鼠体内体外培养单克隆抗体克隆杂交细胞分开不同杂交细胞，克隆专一抗体，检验阳性细胞多种杂交细胞杂交瘤细胞有何特点？本过程利用的那些技术？动物细胞融合技术动物细胞培养技术是否注射抗原（只考虑两两融合）培养液中细胞有几种类型？几种融合细胞？两次筛选的目的分别是什么？（二）、单克隆抗体制备过程与传统制备的抗体相比具有什么特点？第25页，共49页。①诊断疾病（识别作用，如同位素标记单克隆抗体，可诊断肿瘤、心血管畸形等）（三）单克隆抗体的应用优点：准确、高效、简易、快速②用于治疗疾病和运载药物（主要用于癌症治疗，也可运载药物，如“生物导弹”）（导向作用，作为载体，生物导弹=单克隆抗体+药物，治疗肿瘤）（位置准确、疗效高、副作用小）诊断乳腺癌单克隆抗体第26页，共49页。小结两个过程动物细胞融合过程动物细胞培养过程“一二三”二次筛选—筛选杂交瘤细胞、能产生所需抗体的杂交瘤细胞一个新细胞——杂交瘤细胞三个优势——产量大、特异性强、灵敏度高(理化性质单一)的优势单克隆抗体第27页，共49页。2、动植物细胞在结构上有何区别？这与它们杂交或融合过程有什么影响？3、植物体细胞杂交诱导原生质体融合常用的方法有哪些？离心、振动、电激等物理方法；PEG等化学方法问题讨论动物细胞无细胞壁，动物细胞融合过程中不须去除细胞壁和再生出细胞壁。１、植物体细胞杂交最终得到的是完整的植物个体，动物细胞融合后能形成杂种动物个体吗？

不能，只能得到杂交细胞第28页，共49页。4、动物细胞融合能利用上述两类方法吗？还有其他方法吗？能，还可以利用灭活的病毒（生物方法）进行诱导问题讨论５、动物细胞融合与植物原生质体融合的基本原理是否相同？相同，都是细胞膜的流动性第29页，共49页。问题讨论7、动物细胞融合有什么意义？6、为什么要用灭活的病毒？病毒一般对生物体是有伤害的。仙台病毒物理或化学方法丧失感染活性保留融合活性突破了有性杂交方法的局限，使远源杂交成为可能。第30页，共49页。有何同？不同？动物细胞融合动物细胞融合第31页，共49页。植物体细胞杂交与动物细胞融合的比较细胞工程植物体细胞杂交动物细胞融合实质内容改变遗传物质、产生新的性状，获得细胞产品(使后代具有双亲的特性)理论基础细胞膜的流动性;植物细胞全能性细胞膜的流动性;细胞增殖诱导手段物理法：离心、振动、电激化学法：聚乙二醇物理法：离心、振动、电激化学法：聚乙二醇生物法：灭活的病毒诱导过程去细胞壁(纤维素酶、果胶酶)↓原生质体融合(获得杂种原生质体)↓植物细胞培养(获得植株)获得分离的单个动物细胞(胰蛋白酶处理)↓诱导融合↓动物细胞培养(细胞产品)应用获得白菜­甘蓝等杂种植物主要用于单克隆抗体的制备(杂交瘤细胞)第32页，共49页。

1.下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤风杆菌的抗体实验方案2、该方案能达到预期效果吗？为什么？4、图中B为________过程，常用_________作为诱导剂，该细胞继承___________的遗传特性，既能__________,又能___________。1、该实验方案的目的是__________3、A是从小鼠的脾脏中取得_______,该细胞能够产生______5、C过程指细胞培养，该过程包括_____培养和_____培养两个阶段，其中_____代以内的的细胞属于细胞株。制备单克隆抗体B细胞抗体细胞融合灭活病毒双亲细胞分泌抗体无限增殖原代传代50B骨髓瘤细胞杂交瘤细胞足够数量的细胞群A体外培养注射到小鼠腹腔C体外培养不能，未对小鼠免疫处理第33页，共49页。2.人CD20单克隆抗体是治疗一些恶性肿瘤的特效药物，目前主要是通过培养哺乳动物细胞的方式生产。我国科学家已培育出世界上第一头转入了CD20抗体基因的转基因牛，可以从它产的牛奶中直接提取CD20抗体。这项技术成熟后，有望使这一特效药的生产成本降至现在的1/10。请回答：

(1)单克隆抗体的制备过程需先将_____________________和

______________融合，这一过程的诱导方法与植物体细胞杂交不同的是_________________。

(2)动物细胞培养需要在含__________________混合气体的培养箱中进行，培养液中通常需加入________________等一些天然成分。

(3)转基因技术的核心是______________________。该过程用到的工具酶有____________________和_____________。经过免疫的B淋巴细胞骨髓瘤细胞用灭活的病毒诱导95%O2加5%CO2血清、血浆基因表达载体的构建限制性核酸内切酶(限制酶)DNA连接酶第34页，共49页。3.

野生马铃薯品种的植株具有较强的抗病、抗虫、抗盐碱、抗寒能力，但块茎不能食用。俄、德、芬兰专家共同做实验研究，用野生马铃薯与马铃薯的体细胞进行杂交，培育出了生活能力强的杂交系马铃薯。据图分析回答问题：(1)①过程植物细胞原生质体的分离需经过酶解，其中“酶解”所用的酶应该包括________________。(2)②过程可用聚乙二醇(PEG)，其目的是______________________。纤维素酶、果胶酶诱导原生质体融合第35页，共49页。(3)请用文字和箭头表示出④⑤技术过程的实验流程：_____________________________________________。由此过程可以看出植物细胞有形成完整个体的可能性，这是__________________的表现。(4)在培养基上培养一段时间后，原生质体会再生出细胞壁。可以取样，通过__________________________实验来鉴别细胞壁是否已经再生。(5)请说明运用植物体细胞杂交法的最大好处：_______________________________________________。融合细胞愈伤组织幼苗植物细胞具有全能性植物细胞的质壁分离与复原可以克服不同生物远缘杂交不亲和的障碍第36页，共49页。4．下图为细胞融合的简略过程，请据图回答：(1)若A、B是植物细胞，在细胞融合之前已用_______________处理，除去______；A、B到细胞C的过程中，常用的物理方法是________________。融合完成的标志是_______________.(2)若A、B是植物细胞，则形成的D细胞还要应用______________技术把D培养成植株。(3)若A、B是动物细胞，一般取自___________________________________,然后用___________使其分散开来，A、B到C的过程中，常用的不同于植物细胞的手段是________________，所形成的D称为__________(4)若该过程是制备单克隆抗体，A为小鼠B淋巴细胞，那么，在获得此细胞之前，小鼠已被注射了_____，注射后小鼠身体产生了相应的__________，生成了_______________。图中B为_________________。(5)若该过程仍是制备单克隆抗体，在A、B到C的过程中，所形成的C有______种，用来培养的D的细胞应该是_____________。从中选择出它的方法是________________培养，获得D后，常用的培养方法是______________和________________。纤维素酶和果胶酶细胞壁电刺激、振动、离心

产生细胞壁植物组织培养动物胚胎或幼龄动物的器官或组织胰蛋白酶灭活的病毒诱导杂种细胞效应B细胞抗原抗体和记忆细胞骨髓瘤细胞3杂交瘤细胞用特定的选择培养基培养基中培养小鼠腹腔内增殖(1)AB(2)CD第37页，共49页。5.（09山东）人类在预防与诊疗传染性疾病中，经常使用疫苗和抗体。已知某传染性疾病病原体为RNA病毒，该病毒表面A蛋白为主要抗原，其疫苗生产和抗体制备的流程之一如下图：请回答：（1）过程①代表的是____________。（2）过程②构建A基因表过载体时，必须使用____________和_______________________两种工具酶。（3）过程③采用的实验技术是_______，获得的X是_________。（4）对健康人进行该传染病免疫预防时，可选用图中基因工程生产的______所制备的疫苗。对该传染病疑似患者确诊时，从疑似患者体内分离病毒，与已知病毒进行_________________比较；或用图中的_____________________进行特异性结合检测。逆转录限制酶(限制性内切酶）

DNA连接酶细胞融合杂交瘤细胞A蛋白

核酸（基因）序列抗A蛋白的单克隆抗体第38页，共49页。6.(09年宁夏)回答下列有关动物细胞培养的问题：（1）动物细胞培养过程中。当贴壁细胞分裂生长到细胞表面__________时，细胞会停止分裂增殖，这种现象称为细胞_________。此时，瓶壁上形成的细胞层数是_________。要使贴壁的细胞从瓶壁上分离下来，需要用酶处理，可用的酶是____________。（2）随着细胞传代次数的增多，绝大部分细胞分裂停止，进而出现__________现象；但极少数细胞可以连续增殖，其中有些细胞会因遗传物质发生改变而变成______细胞，该种细胞的黏着性______，细胞膜表面蛋白质（糖蛋白）的量________。（3）现用某种大分子染料，对细胞进行染色时，观察到死细胞被染色，而活细胞不染色，原因是___________________________________________________________（4）检查某种毒物是否能改变细胞染色体的数目，最好选用细胞分裂到___期的细胞用显微镜进行观察。（5）在细胞培养过程中，通常在___________________条件下保存细胞。因为在这种条件下，细胞中___的活性降低，细胞_____________的速率降低。（6）给患者移植经细胞培养形成的皮肤组织后，发生了排斥现象，这是因为机体把移植的皮肤组织当作_______进行攻击。相互接触

单层（一层）

接触抑制

胰蛋白酶衰老甚至死亡不死性降低减少

由于活细胞的膜具有选择透过性，大分子染料不能进入活细胞内，故活细胞不能着色中冷冻（超低温、液氮）新陈代谢酶抗原第39页，共49页。7.（10福建卷）红细胞生成素(EPO)是体内促进红细胞生成的一种糖蛋白，可用于治疗肾衰性贫血等疾病。由于天然EPO来源极为有限，目前临床上使用的红细胞生成素主要来自于基因工程技术生产的重组人红细胞生成素(rhEPO)，其简要生产流程如右图。请回答：(1)图中①所指的是_____技术。(2)图中②所指的物质是__，③所指的物质是_。(3)培养重组CHO细胞时，为便于清除代谢产物，防止细胞产物积累对细胞自身造成危害，应定期更换________。(4)检测rhEPO的体外活性需用抗rhEPO的单克隆抗体。分泌该单克隆抗体的________细胞，可由rhEPO免疫过的小鼠B淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合而成。PCRmRNArhEPO培养液杂交瘤第40页，共49页。第一节动物细胞培养

知识能力化1．为了使用于培养的动物组织细胞分散开以便配制成一定浓度的细胞悬浮液，选取来的动物组织应选用下列哪种物质处理A.胃蛋白酶B.胰蛋白酶

C.盐酸D.胰脂肪酶2．下列与动物细胞培养有关的表述中，不正确的是（）A．培养液通常含有葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等B．原代培养的细胞一般传至10代左右便会出现生长停滞C．动物细胞培养一般能够传到40～50代，但其遗传物质发生了改变D．动物细胞培养可用于检测有毒物质和获得大量自身健康细胞3．动物细胞培养的细胞来自于 （ ）A．任何个体的细胞 B．只能取自幼龄动物的组织细胞C．只能取自动物胚胎细胞D．胚胎或幼龄动物的器官和组织细胞BCD第41页，共49页。4．动物细胞工程常用的技术手段中，最基础的是（）

A.动物细胞培养

B.动物细胞融合

C.单克隆杭体

D.胚胎、核移植5．在动物细胞培养中有部分细胞可能在培养条件下无限制地传代下去，这种传代细胞称之为:

A．原代培养

B．传代培养

C．细胞株

D．细胞系6．卫生部2005年4月6日发布了《苏丹红危险性报告评估》，报道中提到苏丹红一号是一种人工色素(工业染料)，它在人体内代谢生成相应的胺类。科研人员欲采用一定的技术手段探究苏丹红是否对人体有危害，你认为采取下列哪种技术手段最合适：

A．动物细胞融合

B．动物细胞培养

C．胚胎移植

D．核移植ADB第42页，共49页。7．下列有关动物细胞培养的叙述，不正确的是A.用于培养的细胞大都取自胚胎或幼龄动物的器官或组织B.将所取的组织先用胰蛋白酶等进行处理使其分散成单个细胞C.在培养瓶中要定期用胰蛋白酶使细胞从瓶壁上脱离，制成悬浮液D.动物细胞培养只能传50代左右，所培养的细胞就会衰老死亡8．用于动物细胞培养的组织和细胞大都取自胚胎或出生不久的幼龄动物的器官或组织，其主要原因是这样的组织细胞 （）A.容易产生各种变异

B．具有更强的全能性C.取材十分方便

D．分裂增殖的能力强DD第43页，共49页。第二节植物组织培养

知识能力化1．用高度分化的植物细胞、组织和器官进行组织培养可以形成愈伤组织，下列叙述错误的是（）A.该愈伤组织是细胞经过脱分化和分裂形成的B.该愈伤组织的细胞没有全能性C.该愈伤组织是由排列疏松的薄壁细胞组成D.该愈伤组织可以形成具有生根发芽能力的胚状结构2.要将胡萝卜韧皮部细胞培养成完整植株，不需要（）A．具有完整细胞核的细胞

B．离体状态C．导入外源基因

D．一定的营养物质和激素3.甘薯种植多年后易积累病毒而导致品种退化。目前生产上