【生物】重组DNA技术的基本工具课件-2023-2024学年高二下人教版（2019）选择性必修3

1944年艾弗里等人通过肺炎链球菌的转化实验，不仅证明了遗传物质是DNA，还证明了DNA可以在同种生物个体间转移。1961年尼伦伯格和马太破译了第一个编码氨基酸的密码子。截至1966年，64个密码子均被破译成功。1970年科学家在细菌中发现了第一个限制性核酸内切酶（简称限制酶）1972年，伯格首先在体外进行了DNA的改造，成功构建了第一个体外重组DNA分子。1982年，第一个基因工程药物-重组人胰岛素被批准上市。基因工程药物成为世界各国研究和投资开发的热点。1953年沃森和克里克建立了DNA双螺旋结构模型并提出了遗传物质自我复制的假说。1967年，科学家发现，在细菌拟核DNA之外的质粒有自我复制能力，并可以在细菌细胞间转移。20世纪70年代初，多种限制酶、DNA连接酶和逆转录酶被相继发现。这些发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。1973年，科学家证明了质粒可以作为基因工程的载体，并实现了物种间的基因交流。至此，基因工程正式问世。1985年，穆里斯等人发明PCR,为获取目的基因提供了有效手段。科技探索之路

基因工程的发展历程例如1：通过重组DNA技术，可以实现利用大肠杆菌生产人的胰岛素。在此实例中，目的基因是_______________，受体细胞是________________，目的基因的表达产物是____________。1.基因工程的概念：基因工程是指按照人们的愿望，通过________等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做__________技术。

转基因重组DNA人胰岛素基因大肠杆菌细胞人胰岛素例如2：萤火虫发光基因普通动植物2.对基因工程概念的理解：基因工程的别名：操作对象：操作水平：基本过程：

原理：

结果：重组DNA技术、转基因技术基因DNA分子水平剪切→拼接→导入→表达基因重组创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品克服远缘杂交不亲和障碍、定向改造生物性状

优点：“分子手术刀”“分子缝合针”“分子运输车”《金》P80例1、例2拼接的基础①DNA的基本组成单位相同（四种脱氧核苷酸）表达的基础②都遵循碱基互补配对原则③DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构①基因是控制生物性状的结构与功能单位②遗传信息的传递都遵循中心法则③生物界几乎共用一套遗传密码基因

工程问题1:不同生物的基因为什么能拼接？为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞内表达?ATGC腺嘌呤胸腺嘧啶胞嘧啶鸟嘌呤4种脱氧核苷酸种类？o1’2’3’4’5’脱氧核糖【回顾】DNADNA的基本单位？脱氧（核糖）核苷酸中文全称？脱氧核糖核酸5′5′3′3′AP脱氧核糖GP脱氧核糖TP脱氧核糖CP脱氧核糖脱氧核糖GPAPCPTP脱氧核糖脱氧核糖脱氧核糖氢键DNA的平面结构一端有一个游离的磷酸基团另一端有一个羟基（—OH）磷酸二酯键第3章

基因工程工程第1节

重组DNA技术的基本工具情境视频一：从社会中来

转基因木瓜（视频）

番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵袭。当番木瓜被这种病毒感染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计，用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。DNA双螺旋的直径只有2nm,对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。转基因番木瓜非转基因番木瓜问题1:解决培育番木瓜的关键步骤需要哪些分子工具呢？这些“分子工具”各具有什么特征呢？限制酶的来源？种类？特点？识别序列长度？切割结果？为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？

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1合作探究一：请同学们自主阅读教材P70-71，小组合作思考讨论完成问题。

推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么？某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？几个末端？一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”主要是原核生物来源种类数千种限制酶不是一种酶，而是一类酶特点（1）识别双链DNA分子特定核苷酸序列（2）断开磷酸二酯键识别序列长度一般为4~8个或其他数量的核苷酸，最常见的为6个核苷酸。专一性TGCCGTAA5'3'5'3'一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”结果形成黏性末端或平末端(1)产生黏性末端EcoRI识别序列为GAATTC切割部位为GA之间当限制酶在它识别序列的中轴线两侧将DNA分子的两条链分别切开时，产生的是黏性末端。GCAATTTATACG5'3'3'5'GCTTAAAATTCG黏性末端错位切一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”结果形成黏性末端或平末端(1)产生平末端SmaI识别序列为CCCGGG切割部位为CG之间平末端当限制酶在它识别序列的中轴线处将DNA分子的两条链分别切开时，产生的是平末端。CGCCGGGCGCGC5'3'3'5'CGCCGGGCGCGC平切一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”限制酶的命名

EcoRⅠ属名Escherichia首字母种名coli前两个字母R型菌株从中分离的第一个限制酶例如：流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)d株中先后分离到3种限制酶，则分别命名为:HindIHindIIHindIII一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”问题2:你能根据所掌握的知识，推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么吗？原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，所以它在长期的进化过程中形成了套完善的防御机制。限制酶就是它的一种防御性工具。当外源DNA入侵时，它会利用限制酶来切割外源DNA，使之失效，以保证自身的安全。问题3:为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？《书》P71一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”问题3:为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？

含某种限制酶的细菌的DNA分子不具备这种限制酶的识别序列，或者甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。《书》P74实战训练

1.写出下列限制酶切割形成的末端序列BamHⅠ

EcoRⅠ__________________________

HindⅢ

BglⅡ_________________________-G-CCTAG-G-CTTAA-A-TTCGA-A-TCTAGorGATCC-G-orAATTC-G-orAGCTT-A-orGATCT-A-【思考】同种限制酶切割产生的黏性末端是否相同？

不同限制酶切割产生的黏性末端是否一定不同？相同可能会相同【问题探究1】请判断：以下黏性末端是由

种限制酶作用产生的。3①②③结论：不同的限制酶可能切割形成相同的黏性末端《金》P82例3C5.下面是4种限制酶所识别的DNA分子序列和切割位点图(↓表示切割位点,切口为黏性末端),下列叙述正确的是(

)A.限制酶1和3切出的黏性末端相同B.限制酶1、2、4识别的序列都由4个脱氧核苷酸组成C.在使用限制酶的同时还需要解旋酶D.限制酶1和2切出的DNA片段可通过T4DNA连接酶拼接限制酶2:限制酶3:限制酶4:限制酶1:A《作》P34【问题探究2】下图甲是一个DNA片段，箭头处代表不同限制酶的切点，据图回答：（1）用EcoRⅠ酶切，能得到

种DNA片段；（2）用PstⅠ完全酶切，能得到

种DNA片段；（3）同时用SmaⅠ和PstⅠ完全酶切，能得到

种DNA片段；（4）只用PstⅠ酶切，最多能得到

种DNA片段。2355用同种限制酶切割(EcoRⅠ)TGAATTCGACTTAAGCAGAATTCTTCTTAAGA问题5:把两种来源不同的DNA进行重组，应该怎样处理？缺口怎么办将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。1.作用：2.DNA连接酶—“分子缝合针”3.种类：类型E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶来源________________________功能只缝合____________缝合____________和____________结果恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的_________________大肠杆菌T4噬菌体黏性末端黏性末端平末端磷酸二酯键磷酸二酯键2.作用部位：两个DNA片段要具有互补（相同的）黏性末端才能连接起来把两个DNA片段黏性末端间的缝隙“缝合”起来，注意：DNA连接酶可连接两个双链DNA片段中的DNA单链缺口，但不能直接连接两条单链的DNA！（1）.E·coliDNA连接酶的缝合作用：DNA连接酶将两个双链DNA片段“缝合”连接起来，形成一个双链DNA分子，恢复被限制酶切开的两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键。T4DNA连接酶还可以把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率相对较低。（1）.T4DNA连接酶的缝合作用：①②③【问题探究2】请判断：①和

可形成重组DNA分子，但①和

之间不能。③②【P74拓展应用2】有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶SpeⅠ进行切割，B片段分别用限制酶HindⅢ、XbaⅠ、EcoRⅤ和XhoⅠ进行切割，各限制酶的识别序列和切割位点如下：(1)哪种限制酶切割B片段产生的DNA片段能与限制酶SpeⅠ切割的A片段产生的DNA片段相连接，为什么？XbaⅠ因为XbaⅠ与SpeⅠ切割产生了相同的黏性末端（可互补）CAATTGAGTATCDNA聚合酶连接单个脱氧核苷酸形成单链DNA聚合酶作用示意图：易混易错DNA连接酶DNA聚合酶相同点作用实质化学本质不同点模板作用对象作用结果 用途都能催化形成磷酸二酯键都是蛋白质

不需要需要DNA的一条链作模板形成完整的重组DNA分子形成DNA的一条链基因工程DNA复制只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键名称作用部位作用底物作用结果限制酶DNA连接酶DNA聚合酶DNA(水解)酶解旋酶归纳总结——与DNA相关的五种酶的比较DNA磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键碱基对之间的氢键将双链DNA切成两个或多个片段将两个DNA片段连接为一个DNA分子将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸将双链DNA分子局部解旋为单链DNADNA片段脱氧核苷酸磷酸二酯键DNA《作》P3599.下图表示DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化,图中依次表示限制酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶作用的正确顺序是(

)A.①②③④

B.①②④③C.①④②③

D.①④③②《作》P359C…TATCGTACGATAGGTACTTAA…ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC…GCCGTATG……TCCTAG…AGGATCTTAAGAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATGAATTCCATAC…GGTATG…GAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATG5′3′5′3′5′3′5′3′重组DNA分子思考.讨论问题1:剪刀和透明胶条分别代表哪种“分子工具”？

剪刀代表限制酶；透明胶条代表DNA连接酶。问题2:你插入的DNA片段能称得上一个基因吗？

不能。真正的基因是有遗传效应的DNA片段，且含有几百至几千个不等的碱基对。P73将外源基因送入受体细胞，相当于一种运输工具，比喻为“分子运输车”1.种类：质粒、噬菌体和动植物病毒等。种类用途不同点质粒、噬菌体植物病毒动物病毒将外源基因导入大肠杆菌等受体细胞将外源基因导入植物细胞将外源基因导入动物细胞来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小也有很大差别基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”三2.最常用的载体——质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。DNA分子复制的起点特殊的标记基因用于鉴别和筛选含有目的基因的受体细胞标记基因通常有:①抗生素的抗性基因，如:抗氨苄青霉素基因(ampr)、抗四环素基因(tetr)②荧光蛋白基因，如:绿色荧光蛋白基因(GFP)、红色荧光蛋白基因(RFP)质粒有___个游离的磷酸基团03.★载体作为载体所具备的条件及原因①有一个至多个限制酶切割位点供外源DNA片段（基因）插入其中②在受体细胞中稳定存在并能自我复制或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制使外源基因在受体细胞中稳定存在并复制，以扩增外源基因的数量③具有特殊的标记基因便于重组DNA分子的筛选④无毒害作用避免受体细胞受到损伤4.质粒的作用①作为运输工具，将外源基因导入受体细胞。②质粒携带外源DNA片段在细胞内大量复制或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的1、选目的基因两端和运载体都有的酶切位点；2、所选酶切位点不能破坏目的基因以及标记基因规律：---选择酶切位点的原则：《金》P82例4、51.“分子手术刀”——

1）来源：

2）作用：

3）作用结果：2.“分子缝合线”——

1）作用：

2）分类：3.“分子运输车”——

1）作用：

2）种类：

3）应具备条件：

限制酶

产生黏性末端、平末端

DNA连接酶将不同的DNA片段连接起来磷酸二酯键将外源基因送入受体细胞质粒（最常用）、噬菌体、动植物病毒E.ColiDNA连接酶、T4DNA连接酶（来源、区别？）主要从原核生物中分离纯化出来。载体识别特定的核苷酸序列，使特定部位的磷酸二酯键断开。作用部位：②能在细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。①有一个至多个限制酶切割位点③具有标记基因④对受体细胞无害——便于重组DNA分子的筛选——供外源DNA片段（目的基因）插入其中小结：基因工程的基本工具原理一原理二原理三思路

：DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法对它们进行提取DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精DNA能溶于物质的量浓度为2mol/L的NaCl溶液在一定温度下，DNA被二苯胺试剂染成蓝色DNA的粗提取和鉴定探究.实验一、实验原理：不同生物的组织中DNA含量不同。在选取材料时，应本着DNA含量高、材料易得、便于提取的原则。你认为如下提供的材料中哪些不适合提取DNA？为什么？供选材料：（括号内为染色体条数）新鲜洋葱（16）、香蕉、菠菜（12）、菜花、猕猴桃（58）；猪肝（38）、鱼卵、鸡血（78）、哺乳动物的成熟红细胞；在液体培养基中培养的大肠杆菌（1）原则上，凡是含有DNA的生物材料都可以考虑；选用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大。1、实验材料的选取利用动物细胞提取DNA破碎细胞的方法：动物细胞无细胞壁，可直接吸水涨破。以血液为实验材料时，每100mL血液中需要加入3g柠檬酸钠，防止血液凝固。二、实验材料及用具：DNA的粗提取和鉴定探究.实验2.试剂：试剂研磨液体积分数为95%的酒精二苯胺2mol/L的NaCl溶液

蒸馏水溶解并提取DNA析出DNA溶解DNA鉴定DNA，要现配现用研磨液成分作用SDS使蛋白质变性EDTA抑制DNA酶Tris-HCl缓冲液稳定DNA二、实验材料及用具：DNA的粗提取和鉴定探究.实验三、实验步骤：1.破碎细胞——称取

，切碎，放入研钵，倒入

，

研磨。洋葱研磨液充分问题2:如果研磨不充分会对实验结果产生怎样的影响？

研磨不充分，会使DNA分子不能从细胞核中释放出来，从而使研磨液中的DNA含量较低，影响最终提取的DNA量。DNA的粗提取和鉴定探究.实验三、实验步骤：2.去除杂质——在漏斗中垫上

过滤研磨液，4℃冰箱中静置后取

；或将研磨液倒入塑料离心管中离心，取

。纱布上清液上清液问题3:过滤能否用滤纸代替纱布？

不可以。因为DNA会被吸附到滤纸上而大量损失，影响最终提取的DNA量。问题4:此步骤获得的上清液中可能含有哪些细胞成分？可能含有DNA、RNA以及蛋白质、脂质、糖类等。DNA的粗提取和鉴定探究.实验三、实验步骤：3.DNA的粗提取——在上清液中加入体积相等的

溶液,静置2~3min，溶液中出现的

就是粗提取的DNA。预冷的酒精白色丝状物用冷却的酒精析出DNA问题5:此步骤的目的是？使蛋白质等溶解在酒精中，DNA不溶于酒精而析出。预冷的酒精的优点①可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；②抑制分子运动，使DNA易形成沉淀析出；③低温有利于增加DNA分子的柔韧性，减少其断裂。DNA的粗提取和鉴定探究.实验三、实验步骤：3.DNA的粗提取——用玻璃棒沿

搅拌，卷起

，并用滤