实验一大肠杆菌的分离和培养专家讲座

试验1大肠杆菌培养和分离实验一大肠杆菌的分离和培养第1页试验目标：1.进行大肠杆菌扩增，利用液体培养基进行细菌培养操作。2.进行大肠杆菌分离，用固体平面培养基本进行细菌划线培养。3.说明大肠杆菌培养条件和试验原理。实验一大肠杆菌的分离和培养第2页一、基础知识(一)微生物:1.特点：结构都相当简单,个体多数十分微小.通常要用光学显微镜或电子显微镜才能看到，有甚至没有细胞结构.且体内普通不含有叶绿素.不能进行光合作用.2.微生物包含五类病毒细菌放线菌真菌原生动物实验一大肠杆菌的分离和培养第3页(二)培养基1.分类(按物理形态分)(1)液体培养基(2)固体培养基惯用固体培养基:

琼脂固体培养基.②微生物在固体培养基表面生长,能够形成肉眼可见菌落.实验一大肠杆菌的分离和培养第4页2.培养基内所含基本物质(1)水(2)碳源(3)氮源(4)无机盐实验一大肠杆菌的分离和培养第5页3.培养基内所需其它条件(1)pH值如:培养霉菌需酸性、培养细菌需中性或微碱性(2)特殊营养物质----?如：培养乳酸杆菌需要在培养基中添加维生素(3)氧气含量如:培养厌氧微生物时需要提供无氧条件生长因子实验一大肠杆菌的分离和培养第6页(三)无菌技术1、取得纯净培养物关键:2、无菌技术四个方面(参看教材20页)3、消毒与灭菌(1)消毒：概念：使用较为温和物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害微生物。包含芽孢和孢子吗？方法:煮沸消毒法巴氏消毒法:如牛奶消毒化学药剂消毒:酒精、氯气、石碳酸、煤酚皂溶液等紫外线消毒(不包含芽孢和孢子)预防外来杂菌入侵实验一大肠杆菌的分离和培养第7页（2）灭菌概念：使用强烈理化原因杀死物体内外全部微生物，包含芽孢和孢子。方法：a

灼烧灭菌b

干热灭菌c

高压蒸汽灭菌灼烧灭菌微生物接种工具(接种环、接种针)或其它金属用具直接在火焰充分燃烧层灼烧注意适用范围实验一大肠杆菌的分离和培养第8页干热灭菌

160－170℃；1－2h能耐高温需要保持干燥物品(玻璃器皿)高压蒸汽灭菌100kPa121℃15-30min通惯用于培养基灭菌实验一大肠杆菌的分离和培养第9页二、试验操作（一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基计算－称量－溶化－灭菌－倒平板（二）分离纯化大肠杆菌接种方法有：划线分离法和涂布分离法（三）将接种后培养基和一个未接种培养基放入37℃恒温箱中培养12h和24h后，观察并统计实验一大肠杆菌的分离和培养第10页三、课题延伸：菌种保藏1、斜面保藏（暂时保留）2、甘油保藏（长久保留）实验一大肠杆菌的分离和培养第11页试验1：大肠杆菌培养和分离设备及用具：灭菌锅或高压锅、250ml三角瓶、封口膜和橡皮圈、直径90mm培养皿、接种环和玻璃三角刮刀、恒温培养箱、摇床、酒精灯和超净台、一次性塑料手套、装有酒精棉球广口瓶、镊子、有棉塞试管（15mm×120mm）5支试验材料：(1)50mlLB液体培养基：蛋白胨0.5g、酵母提取物0.25g、NaCl0.5g、加水50ml。(2)大肠杆菌菌种斜面(3)空白斜面

实验一大肠杆菌的分离和培养第12页试验步骤(1)灭菌：将配制好50mlLB液体培养基和50mlLB液体培养基分别装入两个250ml三角瓶中，加上封口膜，用高压锅进行灭菌。(2)制平板：在酒精灯火焰旁将固体培养基分别倒在4个培养皿中，使培养基铺平皿底部，待凝，使之形成平面。(3)接种扩大培养：靠近酒精灯火焰将大肠杆菌接种到三角烧瓶液体培养基中，三角烧瓶在37℃摇床振荡培养12h。(4)划线分离：将摇床上培养12h菌液在固体培养基平板上连续划线，然后将盖好培养皿倒置，放在37℃恒温培养箱中进行培养。(5)单菌落接种培养：在无菌操作下将单菌落用接种环取出，再用划线法接种在空白斜面上，在37℃下培养24h,4℃冰箱保留。实验一大肠杆菌的分离和培养第13页单菌落实验一大肠杆菌的分离和培养第14页试验讨论

试验完成后，接触过细菌器皿应怎样处理？试验完成后，全部接触过细菌器皿都必须先高压灭菌后再洗涤，尤其是培养基，有可能被有害菌体污染，在培养繁殖后，大量有害菌体影响人畜健康，也污染环境，所以必须高压灭菌。使用后废弃物也要高压灭菌后再抛弃。对于取样器取样头，通常是灭菌后在超声波清洗器中加洗衣粉洗涤纶30min,再用清水洗净，仍可再用。封口膜也可再用。实验一大肠杆菌的分离和培养第15页无菌技术四个方面（1）对试验操作空间、操作者衣着和手进行清洁和消毒；（2）将培养器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌；（3）为防止周围微生物污染，试验操作应在酒精灯火焰附近旁进行；（4）防止已灭菌处理材料用具与周围物品相接触。(三)无菌技术返回实验一大肠杆菌的分离和培养第16页倒平板实验一大肠杆菌的分离和培养第17页讨论:(1).培养基灭菌后，需要冷却到50℃左右时，才能用来倒平板。你用什么方法来预计培养基温度？(2).为何需要使锥形瓶瓶口经过火焰？(3).平板冷凝后，为何要将平板倒置？(4).在倒平板过程中，假如不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为何？提醒：能够用手触摸盛有培养基锥形瓶，感觉锥形瓶温度下降到刚才不烫手时，就能够进行倒平板了。答：经过灼烧灭菌，预防瓶口微生物污染培养基。答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后培养基表面湿度也比较高，将平板倒置，既能够使培养基表面水分更加好地挥发，又能够预防皿盖上水珠落入培养基，造成污染。答：空气中微生物可能在皿盖与皿底之间培养基上滋生，所以最好不要用这个平板培养微生物。返回实验一大肠杆菌的分离和培养第18页1、平板划线法实验一大肠杆菌的分离和培养第19页讨论:(1).为何在操作第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，依然需要灼烧接种环吗？为何？(2).在灼烧接种环之后，为何要等其冷却后再进行划线？(3).在作第二次以及其后划线操作时，为何总是从上一次划线末端开始划线？答：操作第一步灼烧接种环是为了防止接种环上可能存在微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留菌种，使下一次划线时，接种环上菌种直接起源于上次划线末端，从而经过划线次数增加，使每次划线时菌种数目逐步降低，方便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留菌种，防止细菌污染环境和感染操作者。答：以免接种环温度太高，杀死菌种。答：划线后，线条末端细菌数目比线条起始处要少，每次从上一次划线末端开始，能使细菌数目伴随划线次数增加而逐步降低，最终能得到由单个细菌繁殖而来菌落。返回实验一大肠杆菌的分离和培养第20页2.稀释涂布法:(1)系列稀释操作:实验一大肠杆菌的分离和培养第21页涂布平板操作讨论:涂布平板全部操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释无菌操作要求，想一想，第2步应怎样进行无菌操作？提醒：应从操作各个细节确保“无菌”。比如，酒精灯与培养皿距离要适当、吸管头不要接触任何其它物体、吸管要在酒精灯火焰周围；等等。返回实验一大肠杆菌的分离和培养第22页返回菌落：单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见，含有一定形态结构子细胞群体，叫做菌落。不一样细菌菌落特征不一样菌落是判定菌种主要依据。实验一大肠杆菌的分离和培养第23页(2)碳源可作为碳源物质有:含碳无机物:、、含碳有机物：蛋白质脂肪酸返回不一样微生物所利用碳源不一样异养型微生物碳源为自养型微生物碳源为