微生物的实验室培养详解

关于微生物的实验室培养详解微生物包括：细菌、蓝藻、放线菌、支原体、衣原体原核生物界真菌

原生生物病毒没有细胞结构的生物真核生物有细胞结构的生物第2页,共63页，2024年2月25日，星期天菌落：不同的细菌的菌落特征不同菌落是鉴定菌种的重要依据。一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体。第3页,共63页，2024年2月25日，星期天第4页,共63页，2024年2月25日，星期天培养皿第5页,共63页，2024年2月25日，星期天按成分分按功能分按物理状态分培养基类型合成培养基天然培养基基本培养基选择培养基鉴别培养基固体培养基液体培养基分类：

（一）培养基：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。第6页,共63页，2024年2月25日，星期天选择培养基加入青霉素的培养基:

分离酵母菌、霉菌等真菌加入高浓度食盐的培养基:

分离金黄色葡萄球菌不加氮源的无氮培养基:

分离固氮菌不加含碳有机物的无碳培养基:

分离自养型微生物加入青霉素等抗生素的培养基:

分离导入了目的基因的受体细胞第7页,共63页，2024年2月25日，星期天根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品配制而成，用以鉴别不同种类的微生物。例如，在培养基中加入伊红和美蓝，可以用来鉴别饮用水和乳制品中是否存在大肠杆菌等细菌：如果有大肠杆菌，其代谢产物就与伊红和美蓝结合，使菌落呈深紫色，并带有金属光泽。鉴别培养基第8页,共63页，2024年2月25日，星期天不管哪种培养基，一般都含有水、碳源、和氮源、无机盐等营养物质，另外还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质,例如:生长因子(即细菌生长必需，而自身不能合成的化合物,如维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)以及氧气、二氧化碳、渗透压等的要求。培养基的营养物质第9页,共63页，2024年2月25日，星期天1、获得纯净培养物的关键是什么？2、避免杂菌污染的方法主要包括哪四个方面3、什么是消毒、灭菌，常用方法有哪些？（二）无菌技术第10页,共63页，2024年2月25日，星期天消毒与灭菌消毒：指使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物（不包括芽孢和孢子）。灭菌：指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有微生物，包括芽孢和孢子。灭菌与消毒技术是微生物有关工作中最普通也是最重要的技术。第11页,共63页，2024年2月25日，星期天消毒的方法：1、煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min2、巴氏消毒法：70-75℃下煮30min或80℃下煮15min3、化学药剂消毒法:用75%酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒;氯气消毒水源4、紫外线或化学药物消毒第12页,共63页，2024年2月25日，星期天灭菌的方法：1、灼烧灭菌2、干热灭菌：160-170℃下加热1-2h。3、高压蒸汽灭菌：100kPa、121℃下维持15-30min.第13页,共63页，2024年2月25日，星期天1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。旁栏思考第14页,共63页，2024年2月25日，星期天2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。（1）培养细菌用的培养基与培养皿（2）玻棒、试管、烧瓶和吸管（3）实验操作者的双手答：（1）、（2）需要灭菌；（3）需要消毒。旁栏思考第15页,共63页，2024年2月25日，星期天实验操作

本实验用牛肉膏蛋白胨固体培养基进行大肠杆菌的纯化培养，可分为制备培养基和纯化大肠杆菌两个阶段进行。第16页,共63页，2024年2月25日，星期天2.1微生物的实验室培养.flv第17页,共63页，2024年2月25日，星期天第18页,共63页，2024年2月25日，星期天1.培养基灭菌后，需要冷却到50℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？问题讨论

答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？

答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。第19页,共63页，2024年2月25日，星期天3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？

答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，将平板倒置，既可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染，又可避免培养基中的水分过快地挥发。

答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。第20页,共63页，2024年2月25日，星期天纯化大肠杆菌接种方法有：平板划线法和稀释涂布平板法第21页,共63页，2024年2月25日，星期天

平板划线法:通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作,将聚集的菌钟逐步稀释分散到培养基的表面.

在数次划线后,可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体,这就是菌落.第22页,共63页，2024年2月25日，星期天第23页,共63页，2024年2月25日，星期天微生物的恒温培养第24页,共63页，2024年2月25日，星期天问题讨论

1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？

答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。第25页,共63页，2024年2月25日，星期天

2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？答：以免接种环温度太高，杀死菌种。

3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？

答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。第26页,共63页，2024年2月25日，星期天第27页,共63页，2024年2月25日，星期天第28页,共63页，2024年2月25日，星期天问题讨论

涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2步应如何进行无菌操作？

应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围等等。第29页,共63页，2024年2月25日，星期天固体培养基：菌落第30页,共63页，2024年2月25日，星期天菌种的保存1、临时保藏：接种到固体斜面培养基，菌落长成后置于4℃冰箱保存。

2、长期保存：甘油冷冻管藏法第31页,共63页，2024年2月25日，星期天第32页,共63页，2024年2月25日，星期天课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数第33页,共63页，2024年2月25日，星期天一、课题背景1、尿素的利用

尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。2、细菌利用尿素的原因土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶CO(NH2)脲酶+CO2NH3+H2O第34页,共63页，2024年2月25日，星期天4、课题目的①从土壤中分离出能够分解尿素的细菌②统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌第35页,共63页，2024年2月25日，星期天一.研究思路㈠.筛选菌株㈡.统计菌落数目㈢.设置对照第36页,共63页，2024年2月25日，星期天1、实例：启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。原因：因为热泉温度70～800C，淘汰了绝大多数微生物只有Taq细菌被筛选出来。DNA多聚酶链式反应是一种在体外将少量DNA大量复制的技术，此项技术要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。㈠.筛选菌株第37页,共63页，2024年2月25日，星期天2、实验室中微生物的筛选原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。什么是选择性培养基？第38页,共63页，2024年2月25日，星期天15.0g琼脂1.0g尿素10.0g葡萄糖0.2gMgSO4`7H2O2.1gNaH2PO41.4gKH2PO43、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：①从物理性质看此培养基属于哪类？固体培养基第39页,共63页，2024年2月25日，星期天②在此培养基中哪些作为碳源、氮源？碳源：葡萄糖、尿素氮源：尿素培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。5、培养基选择分解尿素的微生物的原理第40页,共63页，2024年2月25日，星期天6、怎样证明此培养基具有选择性呢？以尿素为唯一氮源的培养基牛肉膏蛋白胨培养基

是分离尿素细菌判断该培养基有无选择性实验组对照组培养基类型是否接种

目的

结果只生长尿素细菌生长多种微生物是第41页,共63页，2024年2月25日，星期天6、怎样证明此培养基具有选择性呢？以尿素为唯一氮源的培养基牛肉膏蛋白胨培养基

是分离尿素细菌判断该培养基有无选择性实验组对照组培养基类型是否接种

目的

结果只生长尿素细菌生长多种微生物是第42页,共63页，2024年2月25日，星期天1、显微镜直接计数：利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。㈡.统计菌落数目：不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；缺点第43页,共63页，2024年2月25日，星期天2.间接计数法（活菌计数法）⑴原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。⑵常用方法：稀释涂布平板法。每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。第44页,共63页，2024年2月25日，星期天注意事项①为了保证结果准确，一般选择菌落数在30——300的平板上进行计数。②为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的平皿中，经涂布，培养计算出菌落平均数。③统计的菌落往往比活菌的实际数目低。第45页,共63页，2024年2月25日，星期天设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。㈢.设置对照：第46页,共63页，2024年2月25日，星期天实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时，A同学从对应的106

倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约50个菌落。分析其原因。原因：⑴土样不同，⑵培养基污染或操作失误

(或者是混入了其他的含氮物质)第47页,共63页，2024年2月25日，星期天小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。方案一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。结果预测：如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。第48页,共63页，2024年2月25日，星期天二.实验的具体操作

㈠.土壤取样

从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。◆取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。㈡.制备培养基：制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。第49页,共63页，2024年2月25日，星期天◆应在火焰旁称取土壤10g。◆在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行[三]样品的稀释第50页,共63页，2024年2月25日，星期天㈣.取样涂布◆实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。第51页,共63页，2024年2月25日，星期天㈣.取样涂布◆分离不同的微生物采用不同的稀释度稀释倍数目的细菌104、105、106保证获得菌落数在30～300之间、适于计数的平板放线菌103、104、105真菌102、103、104原因：不同微生物在土壤中含量不同第52页,共63页，2024年2月25日，星期天㈤.微生物的培养与观察思考：要将哪些培养皿进行培养？第53页,共63页，2024年2月25日，星期天㈤.微生物的培养与观察在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。

培养不同微生物往往需要不同培养温度。细菌：30～37℃培养1～2d放线菌：25～28℃培养5～7d霉菌：25～28℃的温度下培养3～4d。第54页,共63页，2024年2月25日，星期天◆如果得到了2个或2个以上菌落数目在30——300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。第55页,共63页，2024年2月25日，星期天微生物的培养与观察第56页,共63页，2024年2月25日，星期天三.结果分析与评价1.通过对