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第第页凝胶层析法分离纯化蛋白质凝胶层析法分别纯化蛋白质试验

凝胶层析法分别纯化蛋白质

凝胶层析法分别纯化蛋白质试验

【目的】掌控凝胶层析的基本原理学习利用凝胶层析法分别纯化蛋白质的试验技能

凝胶层析法分别纯化蛋白质试验

【原理】凝胶层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，依据被分别物质的分子大小不同来进行分离的技术。

凝胶层析法分别纯化蛋白质试验

凝胶过滤层析凝胶层析是根据蛋

白质分子量大小进行分别的技术，又称之凝胶过滤、分子筛层析或排阻层析。

单个凝胶珠本身象“筛子”。不同类型凝胶的筛孔的大小不同。

凝胶层析法分别纯化蛋白质试验

带网孔的葡聚糖珠小分子进入葡聚糖珠内

大分子不能进入珠内，经珠之间缝隙流出

凝胶过滤层析过程示意图

凝胶层析法分别纯化蛋白质试验

凝胶珠

凝胶基质

小分子大分子

凝胶过滤层析过程示意图

凝胶层析法分别纯化蛋白质试验

总结：相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔被完全排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间向下流淌，因此流程较短，移动速度快；所以首先流出。相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网孔，可完全渗透进入凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中，因此流程较长，移动速率慢；所以最末流出。中等大小的分子，它们在凝胶颗粒内外部分渗透，渗透的

程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介于二者之间，这样分子大的组分先流出，分子小的组分后流出。这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的

顺次依次流出，从而达到了分别的目的。

凝胶层析法分别纯化蛋白质试验

【试验器材】层析柱

恒流泵紫外检测仪部分收集器试管等一般玻璃器皿

凝胶层析法分别纯化蛋白质试验

凝胶层析法分别纯化蛋白质试验

凝胶层析法分别纯化蛋白质试验

凝胶层析法分别纯化蛋白质试验

凝胶层析法分别纯化蛋白质试验

【试验试剂】

待分别样品

葡聚糖凝胶Sephade*G-100洗脱液：0.1mol/LpH6.8磷酸缓冲液

凝胶层析法分别纯化蛋白质试验

【操作方法】

一、凝胶的处理Sephade*G-100干粉经蒸馏水室温充分溶胀48h,或沸水浴中煮沸2h,冷却至室温后抽真空脱去颗粒空隙中的空气。

凝胶层析法分别纯化蛋白质试验

二、装柱关闭出口，向柱内加入洗脱液约1cm高，将浓浆状的凝胶缓慢地倾入柱中，使之自然沉降，凝胶沉降约1㎝高度后打开出水口，继续加入凝胶浆，直到凝胶沉积至肯定高度即可。装柱要求连续，均与，无气泡，无“纹路”。

凝胶层析法分别纯化蛋白质试验

三、平衡将洗脱液与恒流泵相连，恒流泵出口端与层析柱入口相连，用2~3倍柱床体积的洗脱液平衡，流速为0.5ml/min。

凝胶层析法分别纯化蛋白质试验

四、加样与洗脱将柱中多余的液体放掉出，使液面刚好盖过凝胶，关闭出口，将1ml样品沿层析柱管壁当心加入，加完后打开底端出口，使液面降至与凝胶面相平常关闭出口，加洗脱液至液层4cm左右，接上恒流泵，开始洗脱(0.5ml/min)。

凝胶层析法分别纯化蛋白质试验

五、收集与测定用部分收集器收集洗脱液。紫外检测仪280nm处检测，将检测信号输入色谱工作站系统，绘制洗脱曲线。

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