高考生物二轮复习第2讲基因工程大题讲解

【课前自主学习检查】1、基因工程的概念？2、重组DNA技术的基本工具有哪些？3、限制性核酸内切酶的来源？4、限制性核酸内切酶的作用特点？5、限制性核酸内切酶的作用结果？6、DNA连接酶的作用部位？7、DNA连接酶的种类？8、基因工程的基本操作程序主要包括哪几个步骤？今日寄语：第3讲基因工程

大题强化练讲评本节主要解决的困惑引物的设计与计算限制酶的选择及酶切产物的计算（1）重叠延伸PCR①此技术共需四个引物引物2和引物3的突起处代表与模板链不能互补的突变位点，而这两条引物有部分碱基（包括突变位点）是可以互补的。②分别利用引物1和引物2，引物3和引物4进行PCR，得到两个DNA片段③得到的DNA片段可以通过引物2和引物3互补的碱基杂交在一起，它们再在DNA聚合酶的作用下延伸，就能成为一条完整的DNA片段。④最后，用引物1和引物4进行扩增得到含有突变位点的DNA片段。基因定点突变技术1．PCR定点突变技术需要____轮能得到等长的DNA片段例1：（多选）重叠延伸PCR技术是一种通过寡聚核苷酸链之间重叠的部分互相搭桥、互为模板，经过多次PCR扩增。从而获得目的基因的方法。该技术在扩增较长片段的DNA、不同来源的DNA片段拼接、基因的定点诱变等方而具有广泛的应用前景，下图表示利用重叠延伸PCR技术扩增某目的基因的过程。下列叙述正确的是（

）A．引物中G＋C的含量越高，引物与模板DNA结合的稳定性越高B．在第一阶段由于引物2和引物3发生碱基互补配对，因此两者置于不同反应系统中C．引物1、2组成的反应系统和引物3、4组成的反应系统中均进行一次复制，共产生4种双链DNA分子D．引物1、2组成的反应系统中，经第一阶段要形成图示双链DNA，至少要经过3次复制AB（2）大引物PCR①大引物PCR需要用到三条引物进行两轮PCR，这三条引物分别是突变上游引物、常规上游引物和常规下游引物。②首先利用突变上游引物和常规下游引物进行扩增，得到不完整的含有突变位点的DNA片段；③利用第一轮扩增产物片段中的一条DNA链作为下游大引物，它与常规上游引物一起扩增得到完整的含有突变位点的DNA选择哪条链作为下游大引物？例2：定点诱变技术是近年来生物工程研究中发展迅速的一个领域。通过定点诱变可以在体外改造目的DNA分子，进而研究基因的表达以及蛋白质的结构与功能之间的关系。经典的大引物PCR定点诱变技术成为基于PCR的定点诱变技术中应用最普遍的方法，操作过程如图甲。研究者欲改造某基因并将其导入大肠杆菌的质粒中保存，该质粒含有氨青霉素抗性基因、LacZ基因及一些酶切位点，结构如图乙。回答下列问题：(1)利用大引物PCR进行定点诱变需要进行两轮PCR（PCR1和PCR2），在PCR1中，至少需要_________个循环才能获得相应的大引物模板。在PCR2中，要获得带有诱变点的改良基因，引物应选用大引物两条链中的_________（填“①”或“②”）。2②5.水蛭素是一种蛋白质，可用于预防和治疗血栓。某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定突变，使水蛭素第47位地天冬酰胺（密码子为AAC、AAU）替换为赖氨酸（密码子为AAA、AAG），从而提高水蛭素的抗凝血活性。原理见下图。重叠延伸PCR技术∶一项重要的基因定点突变技术，其主要设计思路是用具有互补配对片段的引物（图中的引物2和3，突起处代表与模板链不能互补的突变位点），分别进行PCR，获得有重叠链的两种DNA片段，再在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸获得想要的目的基因。（1）由以上事例可知，要对蛋白质的结构进行改造，需要通过______来完成。（2）若拟突变位点的碱基对为A-T，则需要让其突变为_______才能达到目的。引物2的突变位点（突起处）应设计为__________（假设引物为单链DNA）。（3）在第一阶段获得两种具有重叠片段DNA的过程中，引物1、引物2组成的反应系统和引物3、引物4组成的反应系统中均进行一次复制，共产生____种DNA分子。该阶段必须将引物1、2和引物3、4置于不同反应系统中，这是因为______________。（4）利用重叠延伸PCR技术还可以将两个不同来源的DNA片段拼接起来。有人想利用该技术把基因M和N拼接在一起，设计基因M的引物M1、M2，基因N的引物N1、N2。在设计这4种引物时，特别要注意的问题是_____________________。【答案】

(1).改造基因（基因定点突变）

(2).T-A或C-G(3).A或G(4).3(5).引物2和3中存在互补配对片段，置于同一反应系统时它们会发生结合而失去作用

(6).M1、M2中的一种引物与N1、N2中的一种引物必须具有互补配对的片段【当堂检测】4.C困惑点一：基因工程1.1985年穆里斯等人发明了PCR技术。请回答有关问题：（1）若要使用PCR扩增目的基因，则需要在反应体系中添加的物质有4种脱氧核昔酸、引物、模板和______________________，其中引物的作用是________________________________________________________。（2）PCR中每次循环的步骤依次是_____________________。PCR的产物常用琼脂糖凝胶电泳来鉴定，在凝胶中DNA分子的迁移速率与_________________________________有关。（3）利用PCR技术可以从苏云金杆菌DNA分子中扩增出Bt基因，原因是_________________________________________，至少需要____轮循才能得到只含有Bt基因的片段，经过5轮复制，需要引物____个，其中只含有Bt基因的片段占总DNA片段的比例为_________。耐高温的DNA聚合酶

使耐高温的DNA聚合酶能够从引物的3，端开始连接脱氧核苷酸

变性、复性和延伸

凝胶的浓度、DNA空子的大小和构象引物是根据Bt基因的一段已知序列设计合成的36211/16到第三轮循环时，才开始出现2个两条脱氧核苷酸链等长（即目的基因片段）的子代DNA。（即目的基因片段）经过5轮复制，由于两条模板链不需要引物，所以需要引物的个数为2×25-2=62个引物。利用PCR获取和扩增目的基因过程到第三轮循环时，才开始出现2个两条脱氧核苷酸链等长（即目的基因片段）的子代DNA。注：1）复制三次后，只有C上和B下才是目的基因X，所以3次复制只得到2个目的基因。2）如果进行4次复制可得到8个目的基因。A下可得一个目的基因；B上得一个，B下得二个；C上得二个，C下得一个；D上得一个3）复制次数和目的基因X的关系式是：目的基因（2个两条脱氧核苷酸链等长）的个数=2n-2n经过5轮复制后，其中只含有Bt基因的片段占总DNA片段的计算如下：目的基因的个数是=2n-2n=25-2×5=22，DNA分子的总数是25=32，所以其中只含有Bt基因的片段占总DNA片段的11/16。【点拨提升1】2．（11分）水稻是世界上最重要的粮食作物之一，是全球约半数人口的主粮。然而水稻只有在磷充足的条件下才能保证高产。S基因是番茄线粒体中的磷转运蛋白基因，科研人员将S基因转入水稻体内，以期望获得低磷条件下的高产水稻。操作流程如下：（1）由番茄细胞的总RNA得到cDNA，需要的酶是_____________。从cDNA文库中获取的S基因往往需要利用PCR技术在引物的______端添加限制酶识别序列。已知Ti质粒转录方向为顺时针，相关酶切位点如下表。通过测序已知S基因部分序列如下：5′-ATGGAGAA……CTCCTT-CT-3'3′-TACCTCTT……CAGGAAGA-5′请补充扩增结束后，大多数DNA片段的碱基对序列_________________________。（2）基因表达载体的构建是基因工程的核心工作，该工作的重要意义是____________________________________。基因表达载体除目的基因、标记基因外，还必须含有__________和__________。（3）图中两处筛选时均需在培养基中加入____________。已知GUS基因的产物能催化无色物质K呈现蓝色，若______________________________________________________，则说明S基因在水稻愈伤组织细胞中已成功表达。逆转录酶

5′使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代；同时使目的基因能够表达和发挥作用启动子

终止子氨苄青霉素

经无色物质K处理愈伤组织并筛选出了呈现蓝色的组织1、基因工程的原理是基因重组。2、基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。必背知识点C【变式练习1】3.科学家首次运用基因工程的手段，导入优质纤维高产基因KCS，可提高我国棉花的产量和品质。经过十多年艰苦实验、不断培育，将我国棉花纤维的长度提高了0.3厘米，如今新疆棉花品质位居世界前列。如图1表示含有目的基因KCS的DNA片段长度(bp即碱基对)和部分碱基序列，图2表示一种质粒的结构和部分碱基序列。现有MspI、BamHI、MboI、SmaI4种限制性内切核酸酶，它们识别的碱基序列和酶切位点分别为C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG。据图回答下列问题：（1）培育转基因棉花需要用到的工具有_____________________。（2）若用限制酶SmaI完全切割图中含有目的基因D的DNA片段，其产物长度分别为___________。（3）基因工程中使用的目的基因主要是指____________________。重组质粒中除目的基因外，还必须有_____________________。（4）若将图2中质粒和目的基因D通过同种限制酶处理后进行连接，形成重组质粒，那么应选用的限制酶是_______。经检测，部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中目的基因D不能正确表达，其最有可能的原因是____________________。（5）导入目的基因的植物细胞，经过植物组织培养技术得到幼苗，该技术利用的原理是______。为了提高转基因的成功率，需要通过PCR技术扩增目的基因，以获得目的基因的大量拷贝。（6）在目的基因进行扩增时，加入的引物有A、B两种，引物的作用是_____________________________________，若该目的基因扩增n代，则其中含有A、B引物的DNA分子有______个。（7）PCR过程中退火(复性)温度必须根据引物的碱基数量和种类来设定。如表为根据模板设计的两对引物序列，如图为引物对与模板结合示意图。请判断哪一对引物可采用较高的退火温度:_______________。理由是____________________________。引物对AP1AACTGAAATGTAGCTATCP2TTAAGTCCATTACTCTAC引物对BS1GTCCGACTAGTGGCTGTGS2AGCTGGCGTTTAGCCTCGG-C之间为三个氢键，A-T之间为两个氢键，氢键越多，DNA稳定性越强，由于引物对B中含有C-G碱基对多于引物对A，所以需要的退火温度高引物对序列表限制酶、DNA连接酶、载体

537bp、790bp、661bp编码蛋白质的基因

启动子、终止子、标记基因和复制原点

BamHI同种限制酶切割形成的末端相同，部分目的基因D与质粒反向连接

植物细胞具有全能性

使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始复制

2n-2引物对B4.乙烯具有促进果实成熟的作用，ACC氧化酶和ACC合成酶是番茄细胞内合成乙烯的两个关键酶。利用反义DNA技术(原理如图1)，可以抑制这两个基因的表达，从而使番茄具有耐储存、宜运输的优点。图2为融合ACC氧化酶基因和ACC合成酶基因的反义基因表达载体的结构示意图。回答下列问题：（1）从番茄细胞中提取RNA，利用RT-PCR技术获取ACC氧化酶基因和ACC合成酶基因，即利用RNA和PCR获取目的基因。该技术获取目的基因所需要的酶主要有_____________________________________。（2）合成出的ACC氧化酶基因两端分别含限制酶BamHⅠ和EcoRⅠ的酶切位点，ACC合成酶基因两端含KpnⅠ和Sau3AⅠ的酶切位点，这四种限制酶及其识别序列和切割位点如下图：限制性核酸内切酶识别序列和切割位点限制性核酸内切酶识别序列和切割位点BamHⅠG↓GATCCKpnⅠGGTAC↓CEcoRⅠG↓AATTCSau3AⅠ↓GATC先用限制酶_________________分别对ACC氧化酶基因和ACC合成酶基因进行切割后，再将它们拼接成融合基因，相应的Ti质粒和融合基因均使用限制酶________________进行切割，以确保融合基因能够插入载体中。载体上卡那霉素抗性基因的作用是_____________________。（3）为了获得耐运储存、宜储存的番茄，应将融合基因________(填“正向”或“反向”)插入启动子2A11的下游，原因是___________。（