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文档简介

药物研发和毒性的筛选药物的基本要求安全、有效、质量可控有效安全质量可控Benefit/Risk药理学毒理学第2页,共35页,2024年2月25日,星期天毒理学的研究领域发现和识别外源性毒物的“潜在危害”的“证据”探讨作用原理,为解毒和安全使用提供“理论基础”系统的毒性研究,明确安全性范围。评价危险度评估和管理法规及措施的制订。描述性毒理学毒理机制应用毒理学管理和控制第3页,共35页,2024年2月25日,星期天21世纪毒性试验的发展毒性通路针对性试验毒性试验外源毒物的识别剂量反应建模与外推建模风险背景人群数据和暴露数据第4页,共35页,2024年2月25日,星期天毒性通路21世纪毒性实验分类针对性试验

评价毒性通路的紊乱,而非顶端终点;强调采用细胞或细胞系,尤其是人源细胞的高通量试验方法;采用中通量实验法评价细胞的整体反应

开展相关的实验,以评价代谢物、评估靶组织或者在基因组水平上进一步了解受到影响的细胞过程;限制体内研究的种类和期限,重点关注暴露时间不超出14天的研究;依据最新的化学品分类法,对代表性的受试物作更为详尽的测试第5页,共35页,2024年2月25日,星期天

内源性激素(Endogenoushormones)DNA损伤(DNAdamage)抗氧化剂反应(AntioxidantResponsePathway)PXR、CAR、PPAR和AhR受体(PXR,CAR,PPARandAhRreceptors)低渗(Hypo-osmolarity)Nrf2氧化应激(Nrf2oxidativestress)热休克蛋白(Heat-shockproteins)P38MAPK(P38MAPK)。。。。。。已知的主要的毒性通路第6页,共35页,2024年2月25日,星期天

新药研发的技术模式和研究路径的转变StrategyandImplementationPlanforAdvancingRegulatoryScienceforMedicinalProducts。2013,USFDA8个领域中的第一个:毒理学的现代化,促进革新基于动物实验的传统安全性评价方法,具体包括:开展安全性评价新方法研究:特别是基于生物标记物的评价技术。例如,将细胞、基因芯片、蛋白质组学和代谢组学数据与动物实验、临床研究整合。体外实验以及计算机辅助建模方法的研究细胞株、遗传工程改造的生物组织模型等方法的开发第7页,共35页,2024年2月25日,星期天发现毒理学研究

药物研究早期发现阶段,通过毒理学筛选和评价,及早地发现和淘汰有严重毒性问题、不适合开发的化合物,指导合成更安全有效的化合物。 第8页,共35页,2024年2月25日,星期天意义药理和毒理学家同时采用快速、低耗、高通量筛选系统对一系列新化学物进行药效和毒性的同步筛选,找出候选化合物。确定NCEs的毒性作用机制和定量构效关系,指导化学家合成毒性较低的系列化合物。毒理学家基于该类化合物的毒性机制选出合适的体内动物实验模型,进行体内毒性评价。减少动物,提高成功率降低费用,缩短周期第9页,共35页,2024年2月25日,星期天特点涵盖的毒理学终点广试验方法敏感性高使用的样品量少试验周期短试验技术方法易于掌握,试剂及仪器费用低有效降低新药研发的费用,加快研发进程不受GLP约束第10页,共35页,2024年2月25日,星期天主要技术手段药物毒性的早期优化筛选系统(PreclinicalLeadOptimizationTechnologies,PLOTs)计算机模型或专家系统预测新化学实体的潜在毒性QSAR,insilicotoxicology

“基因修饰”动物模型评价候选新药的毒性、致癌性及其毒作用机制毒理组学(-omics)技术研究药物的毒性机制第11页,共35页,2024年2月25日,星期天1、药物毒性的早期优化筛选系统(PreclinicalLeadOptimizationTechnologies,PLOTs)第12页,共35页,2024年2月25日,星期天1)、一般毒性体外试验MTT法:线粒体脱氢酶活性XTT法:线粒体脱氢酶活性CCK-8法:线粒体脱氢酶活性

LDH法:细胞膜的完整性中性红法:将染料摄入溶酶体的胞吞作用刃天青法:细胞的代谢活性苔盼兰排斥试验:细胞膜的完整性体内试验上下法第13页,共35页,2024年2月25日,星期天肝细胞毒性试验离体肝灌流:评价药物毒物在肝脏的代谢动力学,代谢产物情况,对肝脏的毒性作用以及对肝脏代谢酶的影响等精密切割的肝切片肝细胞培养:人肝细胞、大鼠原代肝细胞、HepG2细胞系离体的亚细胞成分胚胎干细胞(ES)定向分化成的肝细胞样细胞模型:利用人胚胎干细胞分化的肝细胞,一方面通过比较蛋白含量测定(KB分析),细胞活性测定(MTT分析)观察药物对肝细胞增殖的影响;另一方面,选择受试药物刺激肝细胞,检测肝功能相关酶ALT、AST、ALP、LDH等;其三,检测细胞色素p450酶活性,观察药物对其影响。第14页,共35页,2024年2月25日,星期天ADME/T模型及药物相互作用模型(CYP450s、Pgp、Caco-2、Cocktail)应用Caco-2细胞模型评价药物和毒物的吸收情况、重复用药对药物吸收的转运蛋白的影响、药物对肠道细胞的毒作用以及药物吸收的毒性成份等。应用肝微粒体孵育“cocktail”技术,根据药物在肝微粒体中的消除速率以及在各种与药物代谢密切相关的P450酶亚型(如CYP1A2、2C9、2C19、2D6、3A4等)特异性抑制剂存在下的消除速率差异研究,判断何种酶亚型可能参与了该药的代谢。第15页,共35页,2024年2月25日,星期天心脏毒性筛选试验hERG(humanether-a-go-gorelatedgene)钾离子通道模型基于hERG表达系统,通过膜片钳技术观察hERG通道的电生理学特性,构建药物致QT间期延长体外评价模型,对hERG电流的影响,为药物致QT间期延长的安全性评价提供技术手段。膜片钳技术被称为研究离子通道的“金标准”。心肌毒性:利用人胚胎干细胞分化的心肌细胞,通过比较蛋白含量测定(KB分析),细胞活性测定(MTT分析)观察药物对心肌细胞增殖的影响;第16页,共35页,2024年2月25日,星期天肾脏毒性体外:离体灌注的肾脏离体灌注的肾单位、肾组织切片离体的肾小球、LLC-PK1、OK、MDCK、NRK-52E、HK-2细胞体内:早期肾损伤的生物标志物:KIM-1、白蛋白、总蛋白、â2-微球蛋白、胱蛋白酶C(CystatinC)、聚集素(Clusterin)、三叶因子-3(TrefoilFactor-3)

第17页,共35页,2024年2月25日,星期天2)、遗传毒性Ames波动试验Green-Screenassay:利用酵母DNA修复基因RAD54和报告基因构建利用P53报告基因构建体外微核小鼠淋巴瘤细胞试验(MouseLymphomaAssay,MLA)彗星试验第18页,共35页,2024年2月25日,星期天3)、生殖毒性全胚胎培养

(WEC)中脑细胞微团培养(MM)胚胎干细胞试验(EST)第19页,共35页,2024年2月25日,星期天4)、局部毒性皮肤刺激:TER,EPISKINâ,

EPIDERMâ、ORROSITEXâ光毒性:3T3NRU-PT眼刺激:经体外兔去核眼刺激试验(Ex-RET)、眼人组织等价试验(EpiOcular™)、牛经体外角膜混浊透过试验(BCOP)、鸡经体外去核眼刺激试验(CEET)皮肤过敏:局部淋巴结试验(LLNA)、肽反应性试验Alternativetoxicityassay第20页,共35页,2024年2月25日,星期天测试终点体外高通量筛选中通量金标准CYP抑制CYP+荧光标记,IC50HLM+LC-MSCYP诱导PXR,CAR肝切片,人原代细胞hERGDofetilide结合膜片钳肝毒性肝细胞、切片培养组织病理学肾毒性肾细胞、切片培养组织病理学遗传毒性微型Ames,体外微核Amestest安全性药理放射性配体结合,功能检定_高通量毒性筛选(HTS)第21页,共35页,2024年2月25日,星期天高内涵毒性筛选检测被筛样品对细胞形态、生长、分化、迁移、凋亡、代谢途径及信号传导的影响,在实验中获取大量相关信息。筛选模型:人类及啮齿动物相应靶器官(肝、肾、心脏和神经系统)的体外培养细胞检测指标:细胞丢失、DNA降解、核大小、细胞骨架紊乱、DNA损伤反应、氧化应激、有丝分裂指标、应激激酶激活、线粒体功能、细胞周期阻滞第22页,共35页,2024年2月25日,星期天成像技术的应用fPETfMRIOIIRPETMRIMRSIPETUSGMRSISPECT

PETIRX-rayMRICTUSG机能分子代谢生理学解剖学MRI=磁共振成像;CT=电脑断层扫描;USG=超声波扫描术y;MRSI=磁共振波谱成像;PET=正电子成像术;SPECT=单光子发射计算机断层扫描;IR=红外;fPET=功能性正电子成像术;fMRI=功能性磁共振成像;OI=光学成像非侵袭/动物数量减少同一动物的发育

衰老动物用作自身对照同一动物的每天多项研究平行进行解剖和机能评价第23页,共35页,2024年2月25日,星期天2、计算机模型或专家系统预测新化学实体的潜在毒性

QSAR,insilicotoxicology

第24页,共35页,2024年2月25日,星期天药物早期虚拟筛选程序用计算机筛选的方法称为虚拟筛选,或称insilico筛选,成为insilico-invitro-invivo模式。用一系列“基于知识的滤网”对虚拟库“筛选”,以“浓缩”出能够满足预定标准的化合物。这些滤网包括类药性(druglike),药代动力学性质,毒性,知识产权问题以及与受体的互补性或与配体的相似性等,是通过数据库搜寻和计算化学实现的。第25页,共35页,2024年2月25日,星期天计算机辅助药物毒性筛选模型P450酶抑制剂与P450s的相互作用模型分子对接和动力学模拟结合自由能预测化合物的构效关系模型化合物的结构和活性(毒性)计算机辅助药物毒性筛选模型第26页,共35页,2024年2月25日,星期天计算机模型或专家系统Commerciallyavailabletoxicityestimationpackagesareavailabletopredictavarietyoftoxicendpointsincludingmutagenicity,carcinogenicity,teratogenicity,skinandeyeirritationandacutetoxicity:DEREK(DeductiveEstimationofRiskfromExistingKnowledge)-www.chem.leeds.ac.uk/lukHazardExpert–/hazardCASE(ComputerAutomatedStructureEvaluation)– TOPKAT(ToxicityPredictionbyComputerAssisted

Technology)–/products/topkatOncoLogic–DILIsim-druginducedliverinjury(DILI)第27页,共35页,2024年2月25日,星期天ToxEffectsinDrugDesignToxEffectAcute(LD50)Organ-specificeffectsMutagenicityReproductiveeffectsCarcinogenicityProgramsTopkat,AB/LD50AB/Tox*(nextversion)Manyprograms,AB/ToxManyprograms,AB/Tox*Manyprograms,AB/Tox*第28页,共35页,2024年2月25日,星期天3、“基因修饰”动物技术(转基因、基因敲除、人源化基因敲入动物)的应用

第29页,共35页,2024年2月25日,星期天转基因和基因敲除动物模型:肝毒性Hsp70i基因敲除小鼠模型金属硫蛋白(MT)-I/II敲除小鼠γ-谷氨酰转肽酶缺乏小鼠Nrf2基因敲除小鼠Sod2+/-杂合子K

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