DNA的生物合成复制专题省公开课一等奖全国示范课微课金奖课件

(DNABiosynthesis，Replication)

第十一章DNA生物合成(复制)复制是指以亲代DNA为模板合成子链DNA过程。AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+亲代DNA复制叉子代DNA1/45(BasicRulesandSystemofDNAReplication)第一节复制基本规律与体系复制方式——半保留复制固定起始点双向复制半不连续复制复制高保真性基本规律一、复制基本规律(一)半保留复制1.概念DNA合成时，以亲代DNA解开两股单链为模板，按碱基配对规律，合成子代DNA过程。子代DNA，一股单链起源于亲代，另一股单链为新合成。子代和亲代DNA碱基序列一致。这种复制方式称为半保留复制。2/45(1)密度梯度试验

——试验结果支持半保留复制构想。含重氮-DNA细菌培养于普通培养液

第一代继续培养于普通培养液第二代梯度离心结果2.半保留复制试验依据和意义3/45(2)子链继承母链遗传信息几个可能方式全保留式(混合式)半保留式按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA碱基序列一致，即子代保留了亲代全部遗传信息，表达了遗传保守性。是物种稳定性分子基础，但不是绝正确。(3)半保留复制意义4/451.原核生物复制时，DNA从起始点向两个方向解链，形成两个延伸方向相反复制叉，称为双向复制。

(三)双向复制复制中放射自显影示意图环状双链DNA及复制起始点B.复制中两个复制叉C.复制靠近终止点oriterABC(二)固定起始点复制是从含有特异碱基序列复制起始点开始。原核生物(一个起始点)，真核生物(多个起始点)。5/452.真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子复制。习惯上把两个相邻起始点之间距离定为一个复制子。复制子是独立完成复制功效单位。5’3’oriorioriori5’3’5’5’3’3’5’5’3’复制子3’6/45(四)复制半不连续性3

5

3

5

解链方向3´5´3´3´5´领头链(leadingstrand)随从链(laggingstrand)顺解链方向生成子链，复制为连续进行，称为领头链。另一股链复制方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，称为随从链。复制中不连续片段称为岡崎片段(okazakifragment)。

领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制半不连续性。7/451.DNA-pol核酸外切酶活性和及时校读A：DNA-pol外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合活性掺入正确配正确底物。B：碱基配对正确，DNA-pol不表现活性。DNA-polⅠ外切活性聚合活性AGA:CGB:5/3/5/3/无活性(五)复制高保真性8/452.复制保真性碱基选择a)DNA聚合酶靠其大分子结构协调非共价(氢键)与共价键(磷酸二酯键)有序形成。b)嘌呤化学结构能形成顺式和反式构型，与对应嘧啶形成氢键配对，嘌呤应处于反式构型。

3.DNA复制保真性依赖三种机制

a)恪守严格碱基配对规律。b)聚合酶在复制延长时对碱基选择功效。c)复制犯错时DNA-pol及时校读功效。NN9P-RNHHNN6顺式NN9R-PNHHNN6反式9/45二、DNA复制体系

(一)底物(substrate)dATP,dGTP,dCTP,dTTP。(二)模板(template)解开成单链DNA母链。(三)引物(primer)提供3

-OH末端使dNTP能够依次聚合RNA(DNA)片断。(四)酶和蛋白因子1.DNA聚合酶全称为依赖DNADNA聚合酶(DNA-dependentDNApolymerase)，简称DNA-pol。10/45(1)活性：5

3

聚合活性；3

5

外切酶活性能识别错配碱基对，并将其水解；5

3

外切酶活性能切除突变DNA片段。5´AGCTTCAGGATA

3´

|||||||||||3´TCGAAGTCCTAGCGAC5´?11/45大肠杆菌E.coli中三种DNA聚合酶分类DNA聚合酶IDNA聚合酶IIDNA聚合酶III分子量(KD)109120900聚合速率(核苷酸/分)1000—600005ˊ→3ˊ聚合酶活性+++3ˊ→5ˊ外切酶活性+++5ˊ→3ˊ外切酶活性+——生物学功效切除引物延长冈崎片段DNA损伤修复延长子链校读作用校读作用DNA损伤修复(2)原核生物DNA聚合酶DNA-polⅠDNA-polⅡDNA-polⅢ12/45①DNA-polⅠ(109kD)小片段5核酸外切酶活性大片段/Klenow片段

DNA聚合酶活性，

5核酸外切酶活性N端C端木瓜蛋白酶DNA-polⅠKlenow片段是试验室合成DNA惯用工具酶。

功效:对复制中错误进行校读，对复制和修复中出现空隙进行填补。13/45②DNA-polⅡ(120kD)

DNA-polII基因发生突变，细菌依然能存活。它参加DNA损伤应急状态修复。

功效：是原核生物复制延长中真正起催化作用酶。

③DNA-polⅢ(250kD)14/45(3)真核生物DNA聚合酶填补引物空隙，切除修复，重组延长子链主要酶，解螺旋酶活性线粒体DNA复制起始引发，引物酶活性功效+++--3¢→5¢高高高？中5¢→3¢聚合活性25.512.514.04.016.5分子量（kD）εδγβαDNA-pol填补引物空隙，切除修复，重组延长子链主要酶，解螺旋酶活性线粒体DNA复制起始引发，引物酶活性+++--3¢→5¢外切酶活性高高高？中5¢→3¢聚合活性25.512.514.04.016.5分子量（kD）εδγβαDNA-pol参加损伤与修复生物学15/45(1)解螺旋酶(helicase)

利用ATP供能，打开氢键，使DNA双链解开成为两条单链。(2)引物酶(primase)

复制起始时催化生成RNA引物酶。(3)单链DNA结合蛋白(singlestrandedDNAbindingprotein,SSB)

在复制中维持模板处于单链状态并保护单链完整。

2.其它酶与蛋白因子稳定已解开单链单链DNA结合蛋白SSB催化RNA引物生成引物酶DnaG(dnaG)运输和协同DnaBDnaC(dnaC)解开DNA双链解螺旋酶DnaB(dnaB)识别起始点DnaA(dnaA)蛋白因子通用名功效16/4510

8

局部解链后①拓扑异构酶Ⅰ切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；适当初候封闭切口，DNA变为松弛状态。反应不需ATP。②拓扑异构酶Ⅱ切断DNA分子两股链，断端经过切口旋转使超螺旋松弛。利用ATP供能连接断端，DNA分子进入负超螺旋状态。(4)DNA拓扑异构酶(DNAtopoisomerase)指理顺DNA链，改变超螺旋状态酶，分为I型和II型。17/45(5)DNA连接酶(DNAligase)连接DNA链3

-OH末端和相邻DNA链5

-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻DNA链连接成一条完整链。3’HO5’3’3’5’DNA连接酶ATPADP5’3’5’18/45第二节DNA复制过程(TheProcessofDNAReplication)(一)复制起始需要处理两个问题DNA解开成单链，提供模板。合成引物，提供3-OH末端。一、原核生物DNA生物合成

19/45E.coli复制起始点oriCGATTNTTTATTT···GATCTNTTNTATT···GATCTCTTATTAG···11317293244···TGTGGATTA-‖-ACACATATT-‖-TTTGGATAA-‖-ACACCTATT5866166174201209237245

串联重复序列

反向重复序列5

3

5

3

1.DNA解链起始点

20/45DnaADnaB、DnaCDNA拓扑异构酶引物酶SSB3

5

3

5

2.引发体和引物含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域复合结构称为引发体。

21/453

5

3

5

引物是由引物酶催化合成短链RNA分子。

引物3'HO5'引物酶22/45

5'

3'5'dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH3'3'DNA-pol复制延长指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP方式逐一加入引物或延长中子链上，其化学本质是磷酸二酯键不停生成。

(二)复制延长23/45领头链合成1.领头链延长领头链沿着5/→3/方向能够连续延长。24/452.随从链延长25/45复制简图26/45复制延长动画27/451.原核生物基因是环状DNA，双向复制复制片段在复制终止点(ter)处汇合。oriter

E.coli8232oriterSV40500(三)复制终止28/455

5

5

RNA酶OHP5

DNA-polⅠdNTP5

5

PATPADP+Pi5

5

DNA连接酶2.随从链上不连续性片段连接29/45哺乳动物细胞周期DNA合成期G1G2SM二、真核生物DNA生物合成

真核生物DNA复制在细胞周期S期进行，也可分为起始、延长和终止三个阶段，每个阶段基本过程与原核生物DNA复制相同，但存在不少差异。

30/451.真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子复制。复制有时序性，即复制子以分组方式激活而不是同时起动。2.复制起始需要DNA-polα（引物酶活性）和polδ（解螺旋酶活性）参加。还需拓扑酶和复制因子(replicationfactor,RF)。

3.增殖细胞核抗原(proliferationcellnuclearantigen,PCNA)在复制起始和延长中起关键作用。(一)复制起始31/453

5

5

3

领头链3

5

3

5

亲代DNA随从链引物核小体(二)复制延长真核生物聚合酶δ催化子链延长，并有校正功效。引物和冈崎片段(约200bp)都比较短。

32/455

3

3

55

3

3

5+5

3

3

3

3

5

5

1.染色体DNA呈线状，复制在末端停顿。2.复制中岡崎片段连接，复制子之间连接。3.染色体两端DNA子链上复制RNA引物，去除后留下空隙。(三)复制终止33/451.端粒(telomere)指真核生物染色体线性DNA分子末端结构。TTTTGGGGTTTTGGGG…(四)端粒与端粒酶3.功效维持染色体稳定性。维持DNA复制完整性。2.结构特点由末端单链DNA序列和蛋白质组成。末端序列是多重复富含G、C短序列。4.端粒酶(telomerase)端粒酶RNA(humantelomeraseRNA,hTR)端粒酶协同蛋白(humantelomeraseassociatedprotein1,hTP1)端粒酶逆转录酶(humantelomerasereversetranscriptase,hTRT)

34/455.端粒酶催化作用爬行模型真核DNA复制后，两个5ˊ末端引物被切除，缺口无法填补，故DNA将面临屡次复制而逐步缩短问题。35/45第三节DNA损伤与修复突变(Mutation)是指DNA分子中碱基序列改变，又称为DNA损伤(DNAdamage)。意义突变是进化、分化分子基础突变造成基因型改变突变造成死亡突变是一些疾病发病基础(DNADamageandRepair)36/45一、引发突变原因1.物理原因

紫外线(ultraviolet,UV)、各种辐射(一)自发原因(二)诱发原因复制过程中发生突变，可发生10-16频率突变。

PRRNNHOOCH3NNHOOCH3PRRNNHOOCH3NNHOOCH3UV嘧啶二聚体37/452.化学原因常见化学诱变剂化合物类别作用点分子改变碱基类似物如：5-FUA®5-FU®G-A--T--G--C-羟胺类（NH2OH）T®C-T--A--C--G-亚硝酸盐（NO2）C®U-G--C--A--T-烷化剂如：氮芥类G®mGG®mGDNA缺失G3.生物原因如逆转录病毒等。38/45(三)突变类型错配缺失插入重排框移DNA分子上碱基错配称点突变(pointmutation)。(1)转换:发生在同型碱基之间，即嘌呤代替另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。(2)颠换:发生在异型碱基之间，即嘌呤变嘧啶或嘧啶变嘌呤。1.错配(mismatch)2.重排(rearrangement)DNA分子内较大片段交换，称为重组或重排。

39/453.缺失(deletion)、插入(insertion)和框移(frame-shift)

(1)缺失：一个碱基或一段核苷酸链从DNA大分子上消失。(2)插入：原来没有一个碱基或一段核苷酸链插入到DNA大分子中间。(3)缺失或插入都可造成框移突