蛋白质分离纯化和表征

第七章：蛋白质的分离、纯化和表征一、蛋白质的酸碱性质

蛋白质分子由氨基酸组成，因此蛋白质的化学和物理化学性质有些与氨基酸相同，如：1、游离的末端α-氨基和α-羧基；2、侧链上的各种功能基团的化学反应；3、分子的两性电解质性质，能和酸或碱发生作用。

1蛋白质可解离基团可以用滴定法滴定注意：1、某些天然蛋白质中有一部分可解离基团由于埋在分子内部或参与氢键形成而不能被滴定。

2、如果蛋白质变性后可解离基团全部可被滴定。

2什么叫等电点？

对某一种蛋白质来说，在某一pH值，它所带的正电荷与负电荷恰好相等，也即净电荷为零，这一pH值称为蛋白质的等电点。

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蛋白质的等电点和它所含的酸性氨基酸和碱性氨基酸的数量比例有关。4

二、蛋白质的大小与形状(蛋白质分子量测定)

(一)根据化学组成测定分子量：

用化学分析方法测出蛋白质中某一微量元素的含量，并假设蛋白质分子中只含有一个被测的元素原子，则可以由此计算出蛋白质的最低分子量。例如:肌红蛋白含铁0.335%，其最低分子量可按下式算出：最低分子量=铁的原子数55.8

铁的百分含量X100=0.335X100=16700

有时蛋白质分子中某一氨基酸的含量特别少，也可以用这一氨基酸含量的分析结果，计算蛋白质的最低分子量。5

(二)利用渗透压测定分子量：

当用一种半透膜将蛋白质溶液与纯水隔开时，只有水分子能自由地通过半透膜进入蛋白质溶液,而蛋白质分子却不能透过它进入纯水中。这种溶剂分子向溶液单方向的扩散现象称为渗透。由于渗透的结果，溶液内的体积增加，液面升高，直至达到一定的静水压力时维持平衡。这时的静水压力就是溶液在平衡浓度时的渗透压。6

利用渗透压的测定来计算蛋白质分子量时，是通过测定几个不同浓度的渗透压，用范霍夫公式(略)求出蛋白质分子量。

渗透压法测定蛋白质分子量的优缺点

优点：所用的实验装置简单。

缺点：要求被测蛋白质纯度要高，如果蛋白质样品中含有其他杂质蛋白，那么由渗透压测得的结果实际上代表几种蛋白质的平均分子量。

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(三)蛋白质的扩散和扩散系数

1、什么叫扩散？

如小心地把纯水放在蛋白质溶液的上面，则蛋白质分子将从下面的高浓度区向上面的低浓度区迁移，直至达到平衡为止。由于浓度差引起的这种溶质分子的迁移称为扩散。扩散是高浓度向低浓度方向进行的。

82、扩散系数

它在数值上等于当浓度为一个单位时，在一秒钟内通过1厘米2面积而扩散的溶质量

3、影响扩散系数的因素

1)与蛋白质的分子大小和形状有关，扩散系数随分子量的增加而降低。

2)与溶剂的粘度有关，扩散系数随溶剂的粘度增加而降低。

扩散系数一般不单独用来决定分子量，但与沉降系数结合可精确测量蛋白质分子量。9(四)

沉降分析法测定分子量(超速离心机的使用)

在强大的离心力作用时，蛋白质分子就会沉降。沉降的速度：1)与蛋白质的分子大小和密度有关；

2)也与蛋白质分子形状、溶液的密度

和粘度有关。

超速离心法的二个用途

1、测定蛋白质的分子量；

2、分离纯化蛋白质。10超速离心基本原理

1、离心力(Fc)

离心作用是根据在一定角度速度下作圆周运动的任何物体都受到一个向外的离心力进行的。离心力的大小等于离心加速度ω2X与颗粒质量m的乘积，即：

FC＝mω2X

其中ω是旋转角速度，以弧度／秒为单位；X是颗粒离开旋转中心的距离，以cm为单位：m是质量，以克为单位。

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2、相对离心力(RCF)

由于各种离心机转子的半径或者离心管至旋转轴中心的距离不同，离心力随之变化，因此常用“相对离心力”或“数字×g”表示离心力，只要RCF值不变，一个样品可以在不同的离心机上获得相同的结果。相对离心力（RCF）和每分钟的转数（rpm）之间相互转换的计算方法。

RCF=1.119*10-5*r*(rpm）2

式中r为离心转子的半径距离，rpm为转子每分钟的转数。

1213离心分离方法1、差速离心法：(分级超速离心法)

不同的粒子在同一离心条件下，沉降速度不同，通过不断增加相对离心力，使一个非均匀混合液内的大小、形状不同的粒子分部沉淀。2、速率区带离心法：在离心前于离心管内先装入密度梯度介质(如蔗糖、甘油、KBr、CsCl等)，待分离的样品铺在梯度液的顶部、离心管底部或梯度层中间，同梯度液一起离心。3、等密度离心法：(密度梯度离心法)

是在离心前预先配制介质的密度梯度，待分离的样品铺在梯度液顶上或和梯度液先混合，离心开始后，当梯度液由于离心力的作用逐渐形成底浓而管顶稀的密度梯度，与此同时原来分布均匀的粒子也发生重新分布。常用的梯度液是CsCl。14分析性超速离心结构及用途

用途：1．测定生物大分子的相对分子量

2、生物大分子的纯度估计

3、分析生物大分子中的构象变化

15超速离心机工作原理16密度梯度离心法超速离心操作方法17不同的离心转子18(五)凝胶过滤法测定分子量(凝胶层析、分子排阻层析、分子筛层析、凝胶渗透层析)原理

分子形状为线形的或与凝胶能发生吸附作用的蛋白质，则不能用此方法测定分子量。19凝胶过滤的介质（填料）1、葡聚糖凝胶：(Sephadex)Pharmacia公司(瑞典)SephadexG-25G-75G-1001000-50003000—800004000—150000

2、聚丙烯酰胺凝胶:(Bio-gel)Bio-Rad公司(美国)Bio-gelP-4P-10P-150500-40005000-1700050000-150000

3、琼脂糖凝胶：(Sepharose)pharmacia公司(瑞典)Sepharose2B4B6B7-4000万6-2000万1-400万

凝胶珠是多孔的网状结构，凝胶的交联度或孔度决定了凝胶的分级范围。20举例

实验中只要测得几种标准蛋白质的Ve，并以它们的分子量对数(logM)对Ve作图得一直线，用待测样品的Ve即可从图中确定它的分子量。

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(六)SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法

聚丙烯酰胺凝胶板状电泳22聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳23SDS应用原理

蛋白质颗粒在PAGE电泳时，它的迁移率取决于它所带的净电荷以及分子大小和形状等因素。如果在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入SDS和少量的巯基乙醇，则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量，而与原来所带的电荷和分子形状无关。第一，由于SDS是阴离子，使多肽链复盖上负电荷，该电荷量远超过蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别，结果，所有的SDS-蛋白质复合物电泳时都以同样的电荷／蛋白质比向正极移动。第二，改变了蛋白质单体分子的构象，SDS-蛋白质复合物在水溶液中的形状被认为是近似雪茄烟形的长椭圆棒，不同蛋白质的SDS复合物的直径都是一样的约为1.8nm，而长轴长度则随蛋白质的分子量而成正比例地变化。24举例载脂蛋白A-IV的分离纯化25

分子量计算2627用聚丙烯酰胺凝胶法分离纯化蛋白质28(七)蛋白质分子的形状分析

1、X-射线晶体结构分析：此法测定蛋白质分子的形状或构象最精确，但只能给出晶体状态的蛋白质立体结构信息。而不能给出在溶液中的蛋白质形状或构象。

2、摩擦比分析蛋白质形状：蛋白质分子在溶液中的摩擦系数可通过实验测得，通过摩擦系数计算摩擦比。摩擦比越大，反映蛋白质分子的不对称性越高，可衡量蛋白质分子形状偏离真正球体的程度。

29三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀(一)蛋白质的胶体性质

三种溶液的区分：(以分散相质点的直径来衡量)1、真溶液：分散相质点小于1nm。

2、悬浊液：分散相质点大于100nm。

3、胶体溶液：分散相质点介于1-100nm。

蛋白质溶液属于胶体系统。

30蛋白质在胶体系统中保持稳定所具备的三个条件1、分散相的质点大小1-100nm，这样大小的质点在动力学上是稳定的，介质分子对这种质点碰撞的合力不等于零，使它能在介质中作不断的布朗运动；2、分散相的质点带有同种电荷，互相排斥，不易聚集成大颗粒而沉淀；3、分散相的质点能与溶剂形成溶剂化层，例如与水形成水化层，质点有了水化层，相互间不易靠拢而聚集。31

(二)、蛋白质的沉淀

蛋白质在溶液中的稳定性是有条件的、相对的。如果条件发生改变，破坏了蛋白质溶液的稳定性，蛋白质就会从溶液中沉淀出来。

引起蛋白质沉淀的原因

1、加入脱水剂以除去它的水化层。

2、改变溶液的pH达到蛋白质的等电点使质点失去携带相同净电荷。

3、加入电解质破坏双电层，蛋白质分子就会凝集成大的质点而沉淀。32

沉淀蛋白质的几种方法1、盐析法：向蛋白质溶液中加入大量的中性盐(硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等)，使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀。盐析沉淀一般不引起蛋白质变性。2、有机溶剂沉淀法：向蛋白质溶液中加入一定量的极性有机溶剂(甲醇，乙醇或丙酮等)，因引起蛋白质脱去水化层以及降低介电常数而增加带电质点间的相互作用，致使蛋白质颗粒容易凝集而沉淀。3、重金属盐沉淀法：当溶液pH大于等电点时，蛋白质颗粒带负电荷，容易与重金属离子(Hg2+、Pb2+、Cu2+，Ag+等)结成不溶性盐而沉淀。334、生物碱试剂和某些酸类沉淀法：

生物碱试剂是指能引起生物碱沉淀的一类试剂，如鞣酸(单宁酸)，苦味酸(2，4，6—三硝基酚)，钨酸和碘化钾等。某些酸类指的是三氯醋酸，磺基水扬酸和硝酸等。当溶液pH小于等电点时，蛋白质颗粒带正电荷，容易与生物碱试剂和酸类的酸根负离子发生反应生成不溶性盐而沉淀。5、加热变性沉淀法：

几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固。少量盐类能促进蛋白质加热凝固。当蛋白质处于等电点时，加热凝固最完全和最迅速。加热变性可能是由于热变性使蛋白质天然结构解体，疏水基外露，因而破坏了水化层而致。34四、蛋白质分离提纯的一般原则

蛋白质提纯的总目标1、增加纯度或比活性(生物活性)。2、设法除去变性的和不要的蛋白质。3、希望所得蛋白质的产量达到最高值(得率)。

35分离纯化蛋白质的一般程序可分三步1、前处理：

破碎组织和细胞，提取组织或细胞内的蛋白质，并保持天然状态，不丢失生物活性。破碎组织和细胞动物组织和细胞：用电动捣碎机、匀浆器或超声波破碎；植物组织和细胞：由于细胞壁由纤维素、半纤维素和果胶等组成，用石英砂和适当的提取液一起研磨的方法破碎或用纤维素酶处理；细菌细胞的破碎：细菌细胞壁由共价键连接而成的称为肽聚糖的囊状分子组成，非常坚韧。常用超声波振荡、与砂研磨、高压挤压或溶菌酶处理等。36提取组织或细胞内的蛋白质1)如果所要的蛋白质主要集中在某一细胞组分，如细胞核、染色体、核糖体或可溶性的细胞浆等，可用差速离心方法将它们分开。2)如果所要蛋白质是与细胞膜或膜质细胞器结合的，则必须利用超声波或去污剂使膜结构解聚，然后用适当的介质提取。

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2、粗分级：

一般采用分级盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法。这些方法的特点是简便、处理量大，既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白质溶液。

3、细分级：

进一步提纯，一般使用层析法(包括凝胶过滤，离子交换层析，吸附层析以及亲和层析等)。必要时还可选择电泳法(包括区带电泳、等电聚焦等)作为最后的提纯步骤。38结晶蛋白质的制备

一定纯度的蛋白质才能形成结晶，结晶过程也能使蛋白质纯度进一步提高，重结晶可除去少量夹杂的蛋白质。一般结晶状蛋白质具有天然活性。

蛋白质纯度愈高，溶液愈浓就愈容易结晶。结晶的最佳条件是使溶液略处于过饱和状态，要得到适度的过饱和溶液，可借控制温度、加盐盐析，加有机溶剂或调节pH等方法来达到。接入晶种常能加速结晶过程。39五、蛋白质的分离纯化方法

(一)根据分子大小不同的分离方法

1、透析和超过滤透析和超过滤就是利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和其他小分子物质如无机盐，单糖、水等分开。常用的半透膜是玻璃纸、火棉纸和其他合成材料。

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透析：

是将待提纯的蛋白质溶液装在半透膜的透析袋里放在缓冲液中进行，使透析袋内无机盐等小分子物质降低到最小值。41超过滤：是利用压力或离心力，强行使水和其他小溶质分子通过半透膜，而蛋白质留在膜上。422．密度梯度(区带)离心：

前述，此略。3．凝胶过滤：前述，此略。

43(二)利用溶解度差别进行分离

影响蛋白质溶解度的外界因素

1)溶液的pH，2)离子强度，3)介电常数，4)温度。

影响蛋白质溶解度的内在因素在同一条件下，不同蛋白质具有不同的溶解度，这是因为溶解度取决于它们本身的分子结构，如：

1)分子中亲水基团与疏水基团的比例，

2)亲水基团与疏水基团在蛋白质分子表面的排列和由此而产生的偶极距等。

44影响蛋白质溶解度的外界因素

1、pH与蛋白溶解度

蛋白质是两性电解质，带电基团的电荷数量因pH不同而变化

1)当蛋白质处于等电点pH时，蛋白质的净电荷为零，使相邻蛋白质分子之间没有静电斥力，趋于结聚而沉淀，因此当蛋白质处于等电点pH时的溶解度最低。

2)在等电点以上或以下的pH时，蛋白质分子携带同种符号

(或正或负)的净电荷而互相排斥，阻止了单个分子结聚成沉淀物，因此溶解度较大。452、蛋白质的盐溶和盐析：

盐溶：低浓度中性盐可以增加蛋白质的溶解度，这种现象称为盐溶。盐析：高浓度中性盐则使蛋白质沉淀出来，这种现象称为盐析。46盐溶和盐析原理1)盐溶原理：

盐溶是由于蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电表层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质分子与水分子间的相互作用却加强，因而溶解度提高。2)盐析原理：

盐析是由于大量中性盐的加入，使水的活度降低，原来溶液中的大部分自由水转变为盐离子的水化水，从而降低蛋白质极性基团与水分子间的相互作用，破坏蛋白质分子表面的水化层。47盐析法分离、纯化并结晶牛胰脏中酶蛋白举例483．有机溶剂分级法：

与水互溶的有机溶剂(如甲醇、乙醇和丙酮等)能使蛋白质在水中的溶解度显著降低，引起蛋白质沉淀和变性。

为了减少蛋白质变性，可预先将有机溶剂冷却到-40℃至-60℃，然后在不断搅拌下逐滴加入有机溶剂。

蛋白质在有机溶剂中的溶解度随温度、pH和离子强度而变化。在一定温度，pH和离子强度条件下，控制有机溶剂浓度可以达到分离蛋白质目的。

49原理：1、有机溶剂改变介质的介电常数。水是高介电常数物质(20℃时，80)，有机溶剂是低介电常数物质(20℃时，甲醇33，乙醇24，丙酮21.4)，有机溶剂的加入使水溶液的介电常数降低。从而增加两个相反电荷之间的吸引力。使蛋白质分子表面可解离基团的离子化程度减弱，水化程度降低，因此促进了蛋白质分子的聚集和沉淀。2、有机溶剂引起蛋白质沉淀可能与盐析相似，与蛋白质争夺水化水，致使蛋白质聚集产生沉淀。50举例

调节酒精浓度和PH值对血浆蛋白质的分级分离

514．温度对蛋白质溶解度的影响：1)在0-40℃范围内，大部分球状蛋白质的溶解度随温度升高而增加。2)在40-50℃以上，大部分蛋白质变得不稳定并开始变性，一般在中性pH介质中即失去溶解力。3)多数蛋白质在低温下比较稳定，因此蛋白质的分级分离操作一般都在0℃或更低的温度下进行。

52(三)根据电荷不同的分离方法

根据蛋白质的电荷不同即酸碱性质不同分离纯化蛋白质的方法有电泳和离子交换层析两类。531、电泳：定义：

在电场作用下，不处于等电状态的蛋白质分子向着与其电性相反的电极移动，这种现象称电泳。用途：电泳技术可用于氨基酸、肽，蛋白质、核苷酸和核酸等生物分子的分离和制备。

影响因素带电颗粒在电场中的泳动速度主要决定于它所带的净电荷量以及颗粒的大小和形状。54

区带电泳：

是由于在支持物上电泳时各组分因迁移速度不同分布成区带而得名。按其支持介质的物理性状不同可以分成四类

1)滤纸电泳和薄膜电泳：醋酸纤维薄膜电泳和聚酰胺薄膜电泳等

2)粉末电泳：支持介质是淀粉，纤维素粉或硅胶粉等，粉末与适当的溶剂调和，铺设成平板。

3)细丝电泳：如尼龙丝和其他人造丝电泳，这是一类微量电泳；

4)凝胶电泳：常用的支持介质有聚丙烯酰胺和琼脂糖凝胶，前者适于分离蛋白质和寡核苷酸，后者适于分离核酸。

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等电聚焦

等电聚焦时，蛋白质混合物的分离是在含能形成pH梯度两性电解质(Ampholine)的蔗糖介质中进行的。在电场内，每种蛋白质成分将移向并“聚焦”(停留)在等于其等电点的pH梯度处，形成一个很窄的区带。56

双向电泳：蛋白质、氨基酸或寡核苷酸混合物一次电泳往往不能完全分开。在这种情况下可将第一次电泳分开的斑点通过支持介质间的接触吸印转移到第二个支持介质上，旋转900，进行第二次电泳。这种方法被称为双向电泳。

蛋白质双向电泳57InternalstandardShenyangxu

TreatedFig.12-Dproteinmapfromgel3(pH3-10NL,24cm)58

InternalstandardDiseaseTreatedFig.2Fullimageoflivermitochondriaproteome59Fig.33-Dchartsofspot1:Spot82:Spot1660Tble2TheidentifiedproteinspotsbyMALDI-TOFMSandmationSpotNo.ProteinnamePIMrcontroldiseasetreateddisease/controltreated/disease1肌氨酸脱氢酶(Sarcosinedehydrogenase)6.151016797.78±0.4310.50±0.319.81±0.161.35-1.062氨甲酰磷酸合成酶(Carbamo-ylphosphatesynthetase1)6.331644768.21±0.3210.60±0.1811．23±0.361.291.064热休克蛋白60(60kDaheatshockprotein）5.91609175.58±0.3811.43±0.2613.04±0.332.051.145热休克蛋白70(70kDaheatshockprotein）5.97738147.23±0.359.98±0.249.78±0.351.38-1.026醛脱氢酶(Mitochondrialaldehydedehydrogenase）6.69555667.41±0.1910.44±0.3911.8±0.431.411.138硫辛酰胺脱氢酶(2-oxoisovaleratedehydrogenase)7.685013311.84±0.857.46±0.489.10±0.36-1.371.229鸟氨酸氨基转移酶(Ornithineaminotransferase）6.534830210.85±0.487.48±0.566.81±0.40-1.31-1.0910脂酰辅酶A脱氢酶(Acyl-CoAdehydrogenase)8.474473711.70±0.459.37±0.347.21±0.46-1.20-1.2312亚硫酸氧化酶(Sulfiteoxidase）5.79543208.24±0.2111.20±0.6212.32±0.651.361.1015ATP合成酶(ATPsynthase）9.22587907.98±0.519.57±0.1511.58±0.241.201.2116NADH脱氢酶(NADHdehydrogenase）7.57208458.52±0.3610.74±0.347.84±0.681.26-1.27615、离子交换柱层析

方法

阳离子交换树脂含酸性基团如-SO3H(强酸型)或-COOH(弱酸型)可解离出H+离子，当溶液中含有其他阳离子时，如在酸性环境中的氨基酸阳离子，它们可以和H+发生交换而“结合”在树脂上。同样阴离子交换树脂含有碱性基团如-N(CH3)3OH(强碱型)或-NH3OH(弱碱型)可解离出OH—，能和溶液里的阴离子，如和碱性环境中的氨基酸阴离子发生交换而结合在树脂上。

原理62

1、离子交换纤维素(Cellulose)和葡聚糖(Sephadex)阳离子交换剂

63

阴离子交换剂642、洗脱方法：1)改变缓冲液pH，使大分子的电荷减少，从吸附状态变为解吸状态。2)增加缓冲液离子强度，使离子的竞争力加大，将大分子从纤维素上替换下来。3、洗脱方式：1)阶段洗脱，即用几个具有不同洗脱能力的缓冲液分步洗脱。2)梯度洗脱，即在梯度洗脱中缓冲液的洗脱能力是逐渐连续性地增加的。655、梯度洗脱的类型：通常采用的梯度形式有线形，凸形，凹形和复合形四种，使用最多的是线性梯度。一般采用梯度混合器。1