生物免疫分析技术

第四章生物免疫分析技术5/9/20241生物免疫分析技术免疫学方法在食品分析中正得到越来越广泛的运用，其中酶联免疫吸附法（ELISA）已经在食品工业中广泛应用，它能够用于测定人们希望含有的物质，以及不希望含有的物质。例如现在人们所关注的食品安全性问题中一些物质的检测：杀虫剂、药物残留物、激素、生长素、微生物毒素、真菌毒素或肠毒素、天然毒素，以及一些添加剂。免疫分析法具备有效的灵敏度、特异性、快速和低成本的优点；可对大量的样品进行常规分析；能够用于样品的定性筛选，也能够对样品进行定量测定以确定样品中待测组分的含量。5/9/20242生物免疫分析技术4.1免疫的原理Ag+AbAg－Ab特异性、灵敏性在Ag，Ab反应中，用容易示踪的化学物质标记一种反应物，以了解反应是否发生，发生部位，以及发生的程度（即对未知成分的样品进行定性、定位及定量分析）。5/9/20243生物免疫分析技术4.2酶联免疫法免疫酶技术：把抗原抗体的免疫反应和酶的高效催化作用原理有机地结合起来。它具有免疫荧光试验和放射免疫试验的优点，并克服上述两种方法的缺点。酶标记试剂制备容易、稳定、有效期长，免疫酶技术的敏感性接近放射免疫试验，可直接肉眼观察也可借助简单的仪器作定量测定，所得结果比较客观。5/9/20244生物免疫分析技术酶免疫测定或免疫酶技术是指酶标记抗体或酶标记抗体进行的抗原抗体反应。它主要包括两个方面：免疫过氧化物酶法：以过氧化物酶作为标记，与抗原或抗体结合，然后根据酶与其底物间所产生的不溶性颜色产物，借助于光学或电子显微镜观察细胞及亚细胞水平的抗原或抗体。酶联免疫吸附法：根据可溶性抗原或抗体与不溶性固相载体结合后，还保留其免疫活性，结合了作为标记的酶催化作用。5/9/20245生物免疫分析技术ELISA的基本原理和方法ELISA的种类和变化ELISA的特点ELISA的应用实例ELISA5/9/20246生物免疫分析技术4.2.1基本原理它采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。测定的对象可以是抗体也可以是抗原。在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）②酶标记的抗原或抗体（标记物）③酶作用的底物（显色剂）5/9/20247生物免疫分析技术测量时，抗原（抗体）先结合在固相载体上，但仍保留其免疫活性，然后加一种抗体（抗原）与酶结合成的偶联物（标记物），此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性，当偶联物与固相载体上的抗原（抗体）反应结合后，再加上酶的相应底物，即起催化水解或氧化还原反应而呈颜色。5/9/20248生物免疫分析技术颜色反应的深浅与相应的抗体或抗原量成正比，因此可借助于颜色反应的深浅来定量抗体或抗原。

这种有色产物可用肉眼、光学显微镜、电子显微镜观察，也可以用分光光度计（酶标仪）加以测定。

其方法简单，方便迅速，特异性强。5/9/20249生物免疫分析技术4.2.2酶及其底物

酶结合物是酶与抗体或抗原,半抗原在交联剂作用下联结的产物。是ELISA成败的关键试剂，它不仅具有抗体抗原特异的免疫反应，还具有酶促反应，显示出生物放大作用，但不同的酶选用不同的底物，将得到不同的颜色反应。5/9/202410生物免疫分析技术酶底物显色反应

测定波长

辣根过氧化物酶邻苯二胺

四甲替联苯胺

氨基水杨酸

邻联苯甲胺

2,2‘-连胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)铵盐

橘红色

黄色

棕色

兰色

蓝绿色492460449

425

642

碱性磷酸酯酶

4-硝基酚磷酸盐(PNP)

萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐黄色

红色400

500葡萄糖氧化酶

ABTS+HRP+葡萄糖

葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰黄色

深蓝色405420β-Ｄ-半乳糖苷酶

甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG)

硝基酚半乳糖苷(ONPG)荧光

黄色

360,450

420

5/9/202411生物免疫分析技术4.2.3ELISA的种类和变化

（一）双抗体夹心法（二）间接法（三）竞争法（四）双位点一步法（五）捕获法测IgM抗体（六）应用亲和素和生物素的ELISA

5/9/202412生物免疫分析技术（一）双抗体夹心法此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原5/9/202413生物免疫分析技术步骤：A将已知抗体吸附于载体上，温育后清洗；B加入待检标本溶液，使溶液中的抗原与吸附的抗体结合，温育后清洗；C加入酶标记特异性抗体，温育后清洗；D加入酶作用底物，产生显色反应，颜色的改变与所加的待检标本溶液中的抗原量成正比。5/9/202414生物免疫分析技术间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。（二）间接法5/9/202415生物免疫分析技术步骤：A将已知可溶性抗原吸附于载体（聚苯乙烯板或聚乙苯乙烯小珠），经温育后清洗；B加入待检稀释血清，若血清中有相应特异性抗体存在则与吸附的抗原结合，温育后清洗；C加入酶标记的抗球蛋白抗体，此时酶标记抗抗体与吸附的抗原抗体复合物结合，温育后清洗；D加入酶作用底物（或称基质），酶分解底物并显色，用光电比色计测定底物显色深浅，即可推知抗体量。5/9/202416生物免疫分析技术（三）竞争法

此法可用于检测小分子抗原。5/9/202417生物免疫分析技术步骤：A将已知抗体吸附于固相载体表面，温育后清洗；B将可能含抗原的待检溶液和酶标记的已知抗原溶液以适当比例混合，加入已包被的载体孔中，温育后清洗；C加入酶作用的底物，产生显色反应。色深表示结合的酶标记抗原多，而待检溶液中未标记的抗原量少；反之，色浅表示结合的酶标记抗原少，而待检溶液中抗原量多。5/9/202418生物免疫分析技术对照管由于只加酶标抗原，与固相抗体充分结合，故分解底物显色深；测定管的显色程度则随待测抗原和酶标抗原与固相抗体竞争结合的结果而异。如待测抗原量多，竞争性地抑制酶标抗原与固相抗体结合，使固相上结合的酶标抗原量减少。因此，加入底物后显色反应较弱。5/9/202419生物免疫分析技术4.2.4特点特点一：灵敏性该测定法的灵敏度来自酶。众所周知,酶是一种有机催化剂，很少量的酶即可诱导大量的催化反应，产生可供观察的显色反应现象。因此该体系常被称为酶放大体系。ELISA实现了在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体的所在部位，或在微克、甚至纳克水平上对其进行定量。例如，在测定血清中某一物质的含量时，化学比色法的敏感度为mg/ml水平，酶反应测定法的敏感度约为5～10μg/ml。5/9/202420生物免疫分析技术特点二：特异性其特异性来自抗体或抗原的选择性。抗原抗体的结合实质上只发生在抗原的抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之间。由于两者在化学结构和空间构型上呈互补关系，所以抗原抗体反应具有高度的特异性。

5/9/202421生物免疫分析技术例如乙肝病毒中的表面抗原（HBsAg）、e抗原（HBeAg）和核心抗体（HBcAg），虽来源于同一病毒，但仅与其相应的抗体结合，而不与另外两种抗体反应。抗原抗体反应的这种特异性使免疫测定能在一非常复杂的蛋白质化合物（例如血清）中测定某一特定的物质，而不需先分离待检物。5/9/202422生物免疫分析技术ELISA应用实例5/9/202423生物免疫分析技术饲料中盐酸克伦特罗的测定饲料中毒素的测定（主要包括黄曲霉毒素，简曲霉毒素）饲料中有害微生物的快速筛检（如沙门氏菌）甲胺磷残留分析甲基对硫磷残留分析呋喃丹残留分析ELISA在饲料安全检测中的应用ELISA用于农药残留的检测5/9/202424生物免疫分析技术河豚毒素

植物毒素如罌粟硷、吗啡、藻类毒素苯并芘

主要有除草剂与杀虫剂两大类例如杀暝松（FN）、甲氟磷酸异已酶（SOMAN）、草不绿（Alachor）、西维因（Carbaryl）、多菌灵及克菌丹（Captan）等。农药的检测：5/9/202425生物免疫分析技术ELISA检测“非典型肺炎”冠状病毒ELISA在结缔组织病早期诊断中的应用检测抗异质性胞核核糖蛋白A2（hnRNPA2）/类风湿性关节炎（PtA）33抗体ELISA在疾病诊断中的作用ELISA法检测幽门螺杆菌抗体5/9/202426生物免疫分析技术ELISA试剂盒商业资讯5/9/202427生物免疫分析技术ELISA试剂盒5/9/202428生物免疫分析技术5/9/202429生物免疫分析技术酶联免疫井5/9/202430生物免疫分析技术DNM-9602G酶标分析仪DNM-9602标配酶标分析仪

DNM-9602A酶标分析仪几种酶标分析仪5/9/202431生物免疫分析技术4.3放射免疫法放射免疫测定（radioimmunoassay，RIA）是1959年由Berson和Yalow首先用于糖尿病患者胰岛素含量的测定，是一种将同位素分析的灵敏性和抗原抗体反应的特异性这两大特点结合起来的免疫标记测定技术。其优点是灵敏度高、特异性强、精确性好、样品用量少，而且不需要复杂的提纯步骤。缺点是需要特殊的仪器设备和一定的防护条件，而且有些同位素标记物的半衰期较短以及试验废物难以处理，对环境造成放射性污染。5/9/202432生物免疫分析技术放射免疫测定法基本原理放射免疫测定是建立在待测抗原和标记抗原对有限量抗体进行竞争性结合的基础上。待测抗原是指人体内某种微量活性物质（如微生物＆寄生虫抗原、激素、维生素、酶、药物等），而标记抗原使将已知的上述物质标记上放射性同位素，具有示踪作用。5/9/202433生物免疫分析技术将标记抗原（Ag*）和未标记抗原（Ag）与特异性抗体（Ab）相混合，结果形成标记的和未标记的抗原抗体复合物。标记和未标记的抗原竞争与抗体进行结合的现象，成为竞争性抑制作用。

Ag*+AbAg*-Ab

标记抗原

特异性抗体

标记抗原抗体复合物+Ag非标记抗原Ag-Ab非标记抗原抗体复合物5/9/202434生物免疫分析技术4.4荧光免疫法免疫荧光技术是根据抗原抗体反应具有高度的特异性，以荧光素（常用的有异硫氰酸荧光黄FITC和罗丹明RB200)作为标记物，与已知抗体结合。然后将荧光素标记的抗体作为标准试剂，用于鉴定未知的抗原，可在荧光显微镜下检查呈现荧光的特异性抗原抗体复合物及其存在部位。5/9/202435生物免疫分析技术树立质量法制观念、提高全员质量意识。2024/5/92024/5/9Thursday,May9,2024人生得意须尽欢，莫使金樽空对月。2024/5/92024/5/92024/5/95/9/202410:11:56AM安全象只弓，不拉它就松，要想保安全，常把弓弦绷。2024/5/92024/5/92024/5/9May-2409-May-24加强交通建设管理，确保工程建设质量。2024/5/92024/5/92024/5/9Thursday,May9,2024安全在于心细，事故出在麻痹。2024/5/92024/5/92024/5/92024/5/95/9/2024踏实肯干，努力奋斗。2024年5月9日2024/5/92024/5/92024/5/9追求至善凭技术开拓市场，凭管理增创效益，凭服务树立形象。09五月20242024/5/92024/5/92024/5/9严格把控质量关，让生产更加有保障。五月242024/5/92024/5/92024/5/95/9/2024作业标准记得牢，驾轻就熟除烦恼。2024/5/92024/5/909May2024好的事情马上就会到来，一切都是最好的安排。2024/5/92024/5/92024/5/92024/5/9一马当先，全员举绩，梅开二度，业绩保底。2024/5/92024/5/92024/5/92024/5/92024/5/9May-24牢记安全之责，善谋安全之策，力务安全之实。2024/5/9Thursday,May9,2024相信相信得力量。2024/5/92024/5/92024/5/9谢谢大家！5/9/202436生物免疫分析技术生活中的辛苦阻挠不了我对生活的热爱。2024/5/92024/5/9Thursday,May9,2024人生得意须尽欢，莫使金樽空对月。2024/5/92024/5/92024/5/95/9/202410:11:56AM做一枚螺丝钉，那里