病毒病实验室诊断-病毒的增殖与人工培养（动物微生物课件）

动物接种培养的应用：尚无敏感细胞的病毒培养。优点：结果易观察，可建立动物模型。缺点：有饲养条件要求，费用高，动物体内常带有潜伏病毒。动物接种培养动物的物种进化程度在选择实验动物时应该是优先考虑的问题。实验动物“3R”原则“敬畏自然，尊重生命”选择何种微生物等级的实验动物，也应根据各级动物的特点，结合课题研究的水平、内容及目的而定。接种病毒后观察应每日至少2次，根据试验的目的不同，观察不同的反应情况。例如在进行新城疫诊断时需进行ICPI、IVPI。普通动物无特定病原体动物悉生动物无菌动物鸡胚培养采用孵化9～12日龄的鸡胚优点：易管理，操作简单，成本较低。缺点：可能垂直传播，存在卵黄抗体干扰。

绒毛尿囊膜：痘苗病毒、人类疱疹病毒尿囊腔：流感病毒、腮腺炎病毒接种部位羊膜腔：流感病毒的初次分离

卵黄囊：嗜神经病毒

不同病毒对鸡胚敏感性不同。直接法：生长发育情况，痘疹、痘斑，MDT。间接法：尿囊液、羊水进行HA/HI。1．气室2．卵壳3．卵黄囊4．卵白5．尿囊腔6．绒毛尿囊7．胚胎8．羊水腔9．胚外体液膜用的鸡胚细胞培养

贴壁细胞培养

悬浮细胞培养

原代细胞

细胞种类二倍体细胞

传代细胞系

培养方式优点1是离体组织细胞不受机体免疫力影响，易于生长。

2便于人工选择多种敏感细胞供病毒生长。3易于观察病毒的生长特征。4便于收集病毒作进一步检查。缺点成本和技术水平要求较高、操作复杂。离体的新鲜组织或器官，机械处理胰蛋白酶消化加入营养液

单个细胞悬浮细胞计数，调整细胞浓度分装培养瓶内长成单层细胞，称为原代细胞。将长成单层原代细胞胰蛋白酶消化转新的细胞培养瓶

形成单层细胞称次代培养。二倍体细胞：原代细胞多次连续传代后仍保持二倍体染色体特性（含23对染色体），称之为二倍体细胞。传代细胞寿命一般为40~50代，其广泛用于病毒的分离和疫苗的制备。传代细胞系：来源于肿瘤细胞或细胞株传代过程的变异细胞。细胞增殖特征和染色体均类似于肿瘤细胞。不宜用于疫苗的制备，常用于病毒的分离和鉴定。细胞培养瓶单层细胞

病毒在细胞内增殖所引起的特有的细胞病变，称为细胞病变效应（CPE）。细胞变圆、聚集、坏死、溶解或脱落等（多数病毒）LOREM在培养细胞中形成包涵体（狂犬病毒等）ABC形成多核巨细胞/融合细胞（麻疹病毒等）一般程序：标本无菌处理动物接种鸡胚培养细胞培养指标阳性指标阴性

病毒鉴定

盲传2～3代指标阴性病毒阴性活细胞---严格寄生性（缺乏增殖所需的酶系统）敏感细胞---选择性（亲嗜性）复制：即自我复制本身的成分，然后装配成病毒粒子。有囊膜病毒的复制穿入吸附脱壳释放装配、成熟生物合成病毒复制的基本过程吸附穿入脱壳生物合成装配与释放吸附穿入有囊膜病毒的穿入

囊膜与细胞膜融合

吞饮作用

无囊膜病毒的穿入

直接穿入

吞饮作用

囊膜与细胞膜融合囊膜与细胞膜融合吞饮作用脱壳

多数病毒的脱壳与穿入同时进行的。不同病毒的脱壳又各有特色，例如：新城疫病毒经溶酶体酶的作用脱壳。痘病毒的脱壳分为两个阶段进行。呼肠孤病毒只脱去外层衣壳，内层衣壳不脱去，形成亚病毒颗粒。小RNA病毒在吸附的同时，就发生衣壳蛋白消失，即吸附的同时就发生了脱壳。生物合成

生物合成即病毒遗传信息的控制下合成病毒的各种组成成分。早期:病毒特异性酶的合成病毒核酸复制病毒结构蛋白质合成生物合成

有囊膜病毒的生物