植物组织培养基制备（植物组织培养课件）

培养基制备

配制母液

配制培养基

培养基母液配制【知识点】培养基的成分及其配方植物生长调节物质的作用及其特点常用培养基母液的配制方法【技能点】能配制常用培养基母液素质要求：培养学生任务执行力，规范操作、注意安全；具有科学严谨、实事求是的工作态度；具有团队合作交流意识和生态环保意识。一、

培养基成分

培养基的成分主要包括水、无机营养、有机成分、植物生长调节剂、培养物的支持材料（如天然有机物、活性炭、抗生素、硝酸银、抗氧化剂、凝固剂等)。1.水

代谢过程的介质和溶媒。在配制过程中基本上用蒸馏,保证母液及培养基成分的精确性，防止贮藏过程中发霉变质。在大量生产过程中，用的是自然水。2.无机营养植物所需浓度大于0.5mmol/L的矿质元素称为大量元素。（N、P、K、Ga、Mg、S）

植物所需浓度小于0.5mmol/L的矿质元素称为微量元素。（Fe、Mn、Cu、Mo、Zn、Co、B）（“各无机营养的功能、供应形式”部分内容自学教材）①N。功能：是蛋白质、酶、叶绿素、维生素、核酸、磷脂、生物碱等的组成成分，是生命结构和功能物质不可缺少的。②P。功能：是磷脂的主要成分，而磷脂又是细胞膜、细胞核的重要组成部分。磷也是核酸、ATP、辅酶等的组成成分。③K。功能：K对碳水化合物合成、转移、以及氮素代谢等有密切关系，它具有活化酶的作用。④Mg、S和Ca。功能：Mg是叶绿素的组成成分，又是激酶的活化剂；

S是含硫氨基酸所构成蛋白质的组成成分。

Ca是构成细胞壁的一种成分，对细胞分裂、保护质膜不受破坏有显著作用微量元素功能：铁是一些氧化酶、细胞色素氧化酶、过氧化氢酶等的组成成分。同时，它又是叶绿素形成的必要条件。如缺氮，会表现出一种花色素苷的颜色，不能形成导管；缺铁，细胞停止分裂；缺硫，表现出非常明显的褪绿；缺锰或钼，则影响细胞的伸长3、有机成分（1）碳水化合物糖类（碳源、能量，维持培养基一定的渗透压。）使用浓度：2--3%，常用3%。（2）维生素类种类：主要有VB1（盐酸硫胺素）、VB6（盐酸吡哆醇）、VB3(烟酸)、VC(抗坏血酸)等。一般用量为0.1-1.0mg/L。（3）肌醇构建细胞壁。一般浓度为100mg/L（4）氨基酸常用种类：甘氨酸。在10-1000mg/L之间。（5）天然有机化合物常用的有椰乳、番茄汁、马铃薯、水果提取物、酵母提取物等。一般使用浓度在10-20％。二、培养基植物生长调节剂与辅助成分1.植物生长调节剂（1）生长素类常用的生长素有IAA、IBA、NAA、2,4-D等其活性强弱为2,4-D>NAA>IBA>IAA功能：诱导愈伤组织形成，诱导根的分化,促进细胞分裂、伸长生长。在促进生长方面，根对生长素最敏感。在极低的浓度下，就可促进生长,其次是茎和芽。（2）细胞分裂素是腺嘌呤的衍生物，包括6-BA（6－苄基氨基嘌呤）、Kt（kinetin激动素）、ZT（zeatin玉米素）等。其中ZT活性最强，但非常昂贵，

常用的是6-BA。细胞分裂素浓度为0.05-10mg/L。作用：①诱导芽的分化促进侧芽萌发生长，②促进细胞分裂与扩大。③抑制根的分化。2.其他物质（1）琼脂琼脂只是固化剂。90℃以上成为溶胶，冷却至40℃凝固用量：在6-10g/L之间（2）活性炭吸附性，通常使用浓度为0.5-10g/L。（3）抗生物质。种类：抗生物质有青霉素、链霉素、庆大霉素等，用量在5～20mg/L之间。作用：防止菌类污染。（4）抗氧化物。种类半胱氨酸，常用50～200mg/L的浓度，其它抗氧化剂有二硫苏糖醇、谷胱甘肽、硫乙醇、及二乙基二硫氨基甲酸酯等。（5）其它。有玻璃纤维、滤纸桥、海绵等，总的要求是排出的有害物质对培养材料没有影响或影响较小。三、培养基母液配制

母液是欲配制液的浓缩液，这可保证各物质成分的准确性及配制时的快速移取，并便于低温保藏。一般配成比所需浓度高10--100倍的母液。要用蒸馏水或重蒸馏水。称量及定容都要准确。各种药品先以少量水让其充分溶解，然后依次混合。母液配好后放入冰箱内低温保存，用时再按比例稀释。配制方法常有两种：

一是可以将培养基的每种成分配成单一化合物的母液，便于配制不同种类的基本培养基时使用；二是配成几种不同的混合溶液，一般配成大量元素、微量元素、铁盐、维生素等母液，其中维生素、氨基酸类可以分别配制，也可以混在一起。1.基本母液配制流程计算→药品称量→溶解→定容→分装→贴标签→冰箱保存。验证计算结果正确后，根据操作流程配制母液。

注意事项：大量元素母液中CaCl2·2H2O需单独配制，否则易发生沉淀。其次铁盐母液要先将Na2-EDTA和FeSO4·7H2O分别溶解，然后将Na2-EDTA溶液缓慢倒入FeSO4·7H2O溶液中，并充分搅拌并加热5-10min，使其充分螯合。2.母液配制的计算

已知扩大倍数、规定量单位浓度和母液体积，求某一化合物的称取量。称取量=规定量单位浓度×扩大倍数×母液体积例1：若要配制GaCl2·2H2O的母液，其规定量浓度为440mg/L，要求扩大10倍，母液体积为250ml，求所需GaCl2·2H2O的称取量。解答：称取量=440mg/L×10×250ml答：所需GaCl2·2H2O称取量为1100mg。

表1MS母液配制母液种类成分规定量mg/L扩大倍数称取量mg母液体积ml配1L培养基吸取量ml母液1大量元素KNO31900201000NH4NO31650MgSO4·7H2O370CaCl2·2H2O440KH2PO4170母液2铁盐Na2-EDTA37.31001000FeSO4·7H2O27.8案例分析：母液种类成分规定量mg/L扩大倍数称取量/mg/L母液体积ml配1L培养基吸取量ml母液3微量元素H3BO36.21001000MnSO4·4H2O22.3ZnSO4·7H2O8.6KI0.83Na2MoO4·2H2O0.25CuSO4·5H2O0.025CoCl2·6H2O0.025母液4有机甘氨酸2.01001000烟酸0.5肌醇100VB60.5VB10.1续表表1MS母液配制母液种类成分规定量mg/L扩大倍数称取量mg母液体积ml配1L培养基吸取量ml母液1大量元素KNO319002038000100050NH4NO3165033000MgSO4·7H2O3707400CaCl2·2H2O4408800KH2PO41703400母液2铁盐Na2-EDTA37.31003730100010FeSO4·7H2O27.82780案例答案：母液种类成分规定量mg/L扩大倍数称取量/mg/L母液体积ml配1L培养基吸取量ml母液3微量元素H3BO36.2100620100010MnSO4·4H2O22.32230ZnSO4·7H2O8.6860KI0.8383Na2MoO4·2H2O0.2525CuSO4·5H2O0.0252.5CoCl2·6H2O0.0252.5母液4有机甘氨酸2.0100200100010烟酸0.550肌醇10010000VB60.550VB10.110续表4.植物生长调节剂母液浓度一般配成0.1--1mg/ml，用时根据需要取用。注意事项：IAA、IBA、GA先溶于少量的95%酒精中，再加水定容到一定浓度。NAA可溶于热水、强碱或少量的95%酒精中，再加水定容到一定浓度。2,4-D可用少量NaOH溶解后，再加水定容到浓度。KT和BA先溶于少量1mol的HCl中再加水定容。玉米素先溶于少量95%的酒精中，再加热水到一定浓度。例：配制0.1mg/mlNAA母液100ml。计算，称取用量。0.1X100=10mg溶解，加入少量95%酒精后，倒入60~80ml蒸馏水溶解定容，100ml装瓶，贴标签，放1~5℃冰箱中冷藏。案例分析5.母液保存需注明母液名称、用量(ml/L)或倍数或浓度(mg/ml)、配制时间及配制人，然后置于4℃冰箱中保存。母液保存过程中要定期检查，发现有沉淀出现或霉菌产生应弃之无用，重新配制。注意事项：1）母液最好在2~

4℃的冰箱中贮存，特别是有机类物质，贮存时间不宜过长，无机盐母液最好在一个月内用完，如发现有霉菌和沉淀产生，就不能再使用。2）制备母液和营养培养基时，所用蒸馏水或无离子水必须符合标准要求，化学药品必须是高纯度的（即分析纯）。3）称量药物采用高灵敏度的天平，每药品专用一药匙。1、培养基成分：水、无机盐、有机成分、植物生长调节剂、其他支持物质。2、培养基成分的特点3、母液配制流程计算→药品称量→溶解→定容→分装→贴标签→冰箱保存。小结4、计算分析

条件：配制2LMS培养基

以培养基母液成分和激素为主，进行案例分析成分规定量mg/L扩大倍数称取量g母液体积ml吸取量mlKI500500NAA0.01mg/ml100

培养基配制【知识点】MS培养基的调制与分装技术培养基的消毒灭菌与保存方法【技能点】能根据不同的植物和培养目的配制不同的培养基及选择不同的激素水平素质要求：培养学生任务执行力，规范操作、注意安全；具有科学严谨、实事求是的工作态度；具有团队合作交流意识和生态环保意识。一、培养基的类型与特点

1.培养基的种类根据态相不同，培养基分为固体培养基和液体培养基。其区别在于培养基中是否添加了凝固剂。

根据营养水平不同，分为基本培养基和完全培养基。基本培养基就是MS、White培养基。

完全培养基由基本培养基添加适宜的激素和有机附加物组成。

2.培养基的特点根据培养基的成分不同，有MS、B5、White、H、Nitsch、Miller、N6、SH、LS（详见教材）等培养基。1）MS培养基

无机盐类离子浓度较高，为较稳定的平衡溶液。其中钾盐、铵盐和硝酸盐含量较高。广泛用于植物的器官、花药、细胞核原生质体培养。2）White培养基无机盐类浓度较低的培养基。特别适合于生根培养和幼根胚培养。3）N6培养基1974年由我国学者朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养而设计，特点是KNO3和(NH4)2SO4含量较高，不含钼。4）B5培养基含有较低的铵盐，较高的硝酸盐和盐酸硫胺素。在豆科植物中用得较多，也适用于木本植物。5）SH培养基无机盐浓度较高的培养基。在单子叶和双子叶植物上使用效果很好。二、培养基的制备1.培养基的配制与分装固体培养基的配制步骤如下：称取蔗糖、琼脂→在锅内加热溶解蔗糖和琼脂计算→搅匀后调pH移取各母液至量筒内→将量筒内母液倒入锅内↓

↓清理←标识、记录←封口←分装达到规定的量1）蔗糖、琼脂的称取量例：求3%蔗糖和0.5%琼脂的称取量？“3%和0.5%”的含义：表示在1L培养基中蔗糖的含量占3%，琼脂的含量占0.5%。蔗糖=1L×3%=1000ml×0.03=30g琼脂=1L×0.5%=1000ml×0.005=5g2）求母液的吸取量

所需培养基体积（ml）母液吸取量（ml）=

该母液的扩大倍数例：配制1L培养基，需GaCl2·2H2O的10倍母液中吸取多少毫升？母液吸取量（ml）==100ml

3）激素母液激素吸取量=（配方浓度/母液浓度）×培养基体积例：若配方激素NAA浓度为1mg/L，激素母液为0.1mg/mlNAA，求配制1L培养基需要激素母液吸取量？吸取量=（配方浓度/母液浓度）×培养基体积=（1mg/L/0.1mg/ml）×1L=10ml4）移液管的使用

培养基配制操作步骤（以1L为例）1）分配水量：500ml蒸馏水定容母液，500ml蒸馏水溶解糖与琼脂。2）移取母液与溶解糖和琼脂（1）用对应的移液管分别量取母液，移至500ml的量筒内，最后加蒸馏水定容到500ml刻度线；（2）用天平分别称取蔗糖和琼脂，将蔗糖直接倒入锅内，加500ml蒸馏水加热溶解，将琼脂趁热倒入锅内，用玻璃棒搅拌直至完全溶解为止。后关闭电炉。3）将混合的母液倒入锅内与糖和琼脂混合均匀，测定培养基的pH值为6左右，过酸用1NNaOH和过碱用1NHCL调整。4）分装：每培养瓶50ml左右（一般占培养瓶1/3左右）。5）标记与清理：

（1）标明培养基代号、操作人与时间、瓶数即可灭菌。（2）用具清理和洗涤：各种母液按原位置摆整齐，用过的量筒、移液管、烧杯、铝锅等用水洗涤干净，然后按次序放回原处。6）灭菌。注意事项：1）操作前须检查仪器和材料。2）称量操作与移液管使用规范、熟练、准确，要稳。3）定容操作要规范、迅速；液面凹液面与刻度线相切。4）分装时要趁热，速度要快要稳，培养基不能溅在瓶口或接近瓶口内壁。5）封口不能太紧，标签内容要清楚。6）用电注意安全防范工作。2.培养基的消毒灭菌培养基灭菌的意义：培养基在制备过程中常带有杂菌，培养基配置完毕和分装后在24h内完成。培养基常用灭菌方法：1）高压蒸汽灭菌：适用固体培养基和液体培养基。2）过滤灭菌：用于液体培养基或液体添加物。高压蒸汽灭菌：装入了培养基的培养容器装在铁丝篮里，外面包上一层铝箔以防止棉塞在高压灭菌时吸湿，在121℃（1.06kg/cm2）下灭菌15min。注意：灭菌时间取决于温度，而不是压力。灭菌时间与灭菌体积有关培养基蒸汽灭菌所需的最短时间容器的体积(ml)121℃灭菌所需最少时间（min）20-501575-15020250-50025100030150035200040使用方法：①检查仪器仪表（压力表为0）②检查灭菌锅安全水位。若水位不足往外锅加水至安全水位。③关闭上排气阀，在内锅内放入待灭菌物品，盖上锅盖，打开放气阀，对角拧紧锅盖螺帽后关闭放气阀。LS系列立式压力蒸汽灭菌器

④接通电源打开开关，设置灭菌温度和灭菌时间分别为121℃,20min。待压力上升至0.05MPa时缓慢打开上排气阀，将冷空气排尽为0时，关闭排气阀。⑤继续加热待温度上升至121℃、0.1MPa时间维持20min后关闭电源，打开上排气阀，待压力表为0MPa后，打开放气阀，依次打开锅盖，取出物品水平放置。在使用