液相色谱法如何用于药物分析 液相色谱操作规程

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液相色谱法（HighPerformanceLiquidChromatography

HPLC）又称“高压液相色谱”“高速液相色谱”“高分别度液相色谱”“近代柱色谱”等。液相色谱是色谱法的一个紧要分支，以液体为流动相，接受高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分别后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。如今，该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中紧要的分别分析技术应用。尤其是在药物分析领域，有着广泛的应用。

液相色谱在药物分析中的应用，紧要考虑试样的预处理和分析柱、检测器的选择。在试样的预处理上，日前兴起的固相（微）萃取使得很多含量低的成分得到精制提纯，从而适于液相色谱的测定。中药中有些紫外吸取，或无特征紫外吸取的成分，直接用液相色谱测定，其灵敏度和分别度都不尽人意，利用柱前或柱后衍生化法可使这些成分较地测定出来。对于极性大、脂溶性差物质，在YWGCl8柱上不易保留，用十二烷基磺酸钠作为离子对试剂，降低其极性，延长柱上的保留时间，取得较好的分别较果。

将液相色谱和质谱这两个强有力的分析技术在线连接在一起，经过三十年的进展已成为一项较为成熟的分析手段，但是它从形成伊始就存在着问题：从液相色谱流进质谱时，流动相的变化、溶剂的构成、高温高压离子化的问题制约着这种联用技术进展。大气压离子化接口具有去除溶剂和离子化的双重功效，它的引入使得该技术在各个领域得到了广泛的应用。电喷雾离子源是一种软电离技术，一般只生成（MH）和（M—H）—两种分子离子峰，选择性监测（mz）190的负分子离子峰，具有较高的灵敏度、精准度、专一性，充分了低浓度药物讨论的需求。

三维液相色谱法可以同步测定葛根素和阿魏酸两种指标。通过试验证明：假如选择合适的柱温等色谱条件，乙醇作为反相液相色谱流动相，分析中药及中成药中有效成分，既安全又精准。结构相像的物质，一般的检测器难以检测出来，液相色谱—电化学法可以有效地测定黄连粉中仅差一个基团的黄芩苷和黄芩素的含量。样品经色谱柱分别后收集，再经荧光分光光度计测荧光强度，影响因素多，测定多而杂。改进后的液相色谱—荧光法则可以不经衍生化和收集分别物，只经化学处理除杂，浓缩后直接进样即可。用该法测定贯叶连翘中金丝桃素的含量也取得了较好的结果。液相色谱—示差折光测黄芪精口服液中黄芪甲苷的含量也都取得了较为充分的结果。对于只有紫外末端吸取，用紫外检测时灵敏度低，基线易漂移，示差折光检测其易受外界条件干扰，蒸发散射检测器能克服以上不足，响应值只与样品质量有关，其信号相应与质量成正比，不同化合物，质量相同则信号相应基本一致。蒸发光散射检测法是基于不挥发样品分子对光的散射程度与其质量成正比，与其所含基团性质无关。只要选择适当的检测器参数，便可使流动相和溶剂完全气化，不产生信号，而样品中的各个组分以不挥发粒子存在，对光有散射，以被检测出来。因此，蒸发光散射检测器可用于含不同基团的多组分同时分别、分析。和紫外、荧光等方法相比，蒸发光散射检测法对不同物质有貌似相同的响应因子。

在谈到药用辅料检测中的其他液相色谱检测方法时，液相色谱—电感耦合等离子体质谱联用技术作为微量元素测定的有效途径之一，液相色谱高分别度与电感耦合等离子体质谱低检测性、宽动态线性范围及能同时测定多种元素、跟踪元素的变化等特点融合，目前已广泛的用于食品、环境、体内外药物分析中微量元素的测定。该方法应用于药用辅料中微量元素砷、汞、铬等检测的探干脆讨论项目已在试验室开展。目前虽罕见相关报道，随着技术的成熟与仪器的进展，其在药用辅料检测中有着广泛的应用前景。同时，液相色谱—核磁共振联用技术因仪器昂贵，核磁共振灵敏度相对较低，液相色谱需使用氘代溶剂，溶剂信号易对样品产生干扰等，使其在药物分析中广泛应用存在确定障碍，但核磁共振在结构分析方面有独特的优势，能够供应丰富的结构信息，弥补液相色谱通用检测器只能得到特别有限的结构信息的不足，在实际药用辅料杂质分析中已进入使用阶段。

综合上述讨论成果可以知晓，目前液相色谱法在药物分析领域的应用是多方面的。而且为了充分特定的检测需求，液相色谱与多种其他方法、其他仪器联合，不断改进自身缺陷，为药物分析供应更佳的解决方案。信任这项技术在将来还会有更广阔的应用空间。

液相色谱流动相说明

流动相相当于液相的血液，可以想象对液相的紧要程度。那么流动相都需要注意什么呢？

01、过滤溶剂

溶剂在使用前确定要用0.5μm的过滤器过滤，假如使用固体化学试剂（缓冲盐）配制流动相，过滤特别紧要，不能让固体微粒污染泵，堵塞进样器和柱头过滤片。本试验室有水溶性和脂溶性两种过滤膜供选择（反光面朝上），过滤水溶性流动相时（如甲醇/水），先用1～2mL甲醇润湿过滤膜，有助于快速抽滤。

02、保持储液瓶的清洁

用一般溶剂瓶作流动相储液器应不定期废弃瓶子，最后一次应用HPLC级的水或溶剂清洗，不能在清洗过程中留下污迹。

03、保证溶剂的质量

确定要用HPLC级的溶剂，水也应达到HPLC级，同样也要使用高纯度的缓冲盐。

一些因流动相引起的常见问题

01、流动相脱气不充分

流动相受热，或者流动相不同组分混合时会有气体产生，气泡进入泵内引起压力波动，加添噪音，色谱图上显现毛刺。可试用下列方法解决问题：流动相再脱气；接受更有效的脱气方法或两种方法搭配使用；改系统内混合为系统外预混合。

02、流动相供应不畅

流动相用完，管道中吸入气体引起泵压力不稳。应常常察看储液器中流动相的量，加足流动相保证全部的样品分析完毕。输液管道上装沉子沉至瓶底，储液器盖上留一小孔正好夹住进液管，使其不能上下移动。

过滤器堵塞引起管道和泵腔空化，压力不稳。过滤器被微粒所堵塞或长霉，去掉过滤器后假如系统运转正常，说明已找出问题，换上新的过滤器则可。有时候换上新的过滤器仍旧不畅，那就需要查查流动相的制备过程，或者换大孔径的过滤器。不管如何，流动相都需要重新过滤。

流速过高、阻力大，造成空化现象，这是由于过滤器孔径、管道内径、流速和溶剂黏度等引起的。假如流速大于10mL/min，常会显现这种现象。

使用下列方法解决：

（1）使用低流速；

（2）换大孔径的过滤器；

（3）加添进液管道内径；

（4）抬高或加压储液器；

（5）不用过滤器，但流动相确定要先过滤；

（6）储液器盖子太紧，在储液器内形成真空，打出的流动相不连续。应松开盖子或留有1mm的缝隙；

（7）进液管道堵塞或弯曲使泵抽不到液，注意调整进液管道或更换新的。其它问题包括渗漏或接头松动、泵部件损坏等，都能引起供液不正常。

03、流动相和储液器被污染

由于污染，噪音越来越大，检测器基线上升。污染物可能被泵以稳定的浓度打入系统，而再以稳定的浓度流出来，所以在色谱图中不出多余的峰。用梯度洗脱时弱流动相可以使污染物聚在柱顶，流动相强度加添后污染物可能被洗脱出来一个大的伪峰。有时基线噪音蓦地增大或蓦地提高，都是由于反复加进新的流动相或系统用得太久（通宵）所造成的。新加进的流动相有污染物或者流动相长霉，繁殖了细菌。

脏的储液器会污染清洁的流动相。每种流动相备有专用的储液器，或者定期报废储液器。

流动相污染来自这几个方面

04、试剂质量不高，玻璃器皿不合格；

微生物的影响；

配制流