水的细菌检测

GB/T5749-2006《中华人民共和国国家标准生活饮用水标准检验方法》（2007年7月1日执行）规定生活饮用水中微生物指标及限制为:细菌总数（CFU/mL）不得超过100个；注：CFU表示菌落形成单位。项目3污水中菌落总数检测任务3.1菌落总数的检验物品准备工作(一)微生物实验室常用的玻璃器皿培养皿(平皿)：一般直径为9cm。试管：较大的长220mm，直径20mm；较小的长150mm，直径15mm。锥形瓶：—般容量为250mL、500mL。量筒、量杯：用于定量量取各种液体。移液管（吸管）：一般容量为lmL、10mL等。载玻片与盖玻片：普通载玻片大小为75mm×25mm，盖玻片为18mm×l8mm。其他：滴瓶(用来装各种染料、生理盐水等)、烧杯、漏斗等。(二)玻璃器皿的循环使用（三）菌落总数及实验前的准备菌落总数：水样在营养琼脂上有氧条件下37℃培养48h后，所得1mL水样所含菌落的总数。1.培养皿的包扎2.吸管的包扎3.棉塞制作4、试管的包扎5、锥形瓶的包扎6.采样瓶的包扎实验前的准备要求：种类齐全数量富足。任务3.2微生物营养及培养基的制备（一）微生物的营养物质传统上根据功能不同对营养物归类碳源和能源氮源无机盐生长因子等水种类？有机物、无机碳化合物随细菌不同，各有偏好细菌最喜好的碳源是？供碳元素来源的物质细菌细胞中的碳素含量占干物质质量的50％左右。细菌对碳素的需求量最大。碳源作用—细胞的碳骨架、大多还是能源物质。

糖尤其是葡萄糖1、碳源常见的碳源实验室常用的几种碳源：葡萄糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉等发酵工业中常利用的碳源：单糖、饴糖、糖蜜（制糖工业副产品）、淀粉（玉米粉、山芋粉、野生植物淀粉）、麸皮、米糠、酒糟、马铃薯等。微生物分类自养微生物：生长时能以简单的无机物质作为营养物质生长时需要以复杂的有机物质作为营养物质异养微生物细菌的能源种类化学能、光能所有细菌细胞内能量传递体都是ATP营养型细菌分类根据碳源不同分为无机营养——有机营养（或自养——异养）提问：哪些物质可以产生化学能？有机碳源特殊的无机物（如S、Fe)提问：什么样的细菌利用光能？含有光合色素2、能源能源、碳源不同的微生物分类营养类型能源电子供体碳源实例光能无机营养型（光能自养型）光能H2、H2S、S或H2OCO2蓝细菌、紫硫细菌、绿硫细菌、藻类光能有机营养型（光能异养型）光能有机物CO2以及简单有机物红螺菌属的细菌化能无机营养型（化能自养型）无机物H2、H2S、Fe2+、NH4+或NO2-CO2硝化细菌、硫化细菌、铁细菌、氢细菌、硫磺细菌化能有机营养型（化能异养型）有机物有机物有机物绝大多数原核微生物和全部真核微生物提问：哪些物质可作为细菌的氮源？有机氮（氨基酸和蛋白质）、无机氮（N2、NH3、铵盐、硝酸盐）等。实验室中有机氮源——蛋白胨工业投加的细菌氮源？——尿素、粪便3、氮源阴离子盐：磷酸盐、硫酸盐、氯化物、碳酸盐、碳酸氢盐。阳离子盐：氨、钾、钠、钙、镁、铁的盐P和S、Fe、Mg的需求量较大同时还需要锌、锰、钴、铝、铜、硼、钒、镍等微量元素。

4、无机盐种类：嘌呤、嘧啶类、维生素类作用：？嘌呤和嘧啶参与合成核酸和辅酶；维生素，重要辅酶多数细菌不存在生长因子问题。只有少数细菌需要外界提供现成的生长因子，才能生长，如乳酸菌需要多种维生素，因此只能生活在这些物质供应充足的环境，如牛奶中、肠道。——必需，但不能自身合成的有机物5、生长因子提问：水对细菌有哪些作用？1)溶剂作用2)运输物质的载体3)参与生化反应(如脱水、加水反应)

6、水（二）营养物质进入细胞的方式营养物质通过细胞膜的方式主要有4种1.单纯扩散2.促进扩散3.主动运输4.基团转位（磷酸转移酶系统）1）合成培养基合成——纯化学试剂2）天然培养基天然——？纯生物制品(细胞提取物)如，常用的细菌肉汤培养基牛肉膏3g蛋白胨5g水1000mLpH7.2~7.4牛肉膏——瘦牛肉经过加热浓缩抽提的膏状物（主要作碳源）优点——稳定、选择性缺点——很多细菌营养需求较为复杂，配方获取较难1.根据培养基成分划分（三）培养基类型及应用天然培养基合成培养基半合成培养基类似物如酵母膏、麦芽汁、土壤浸出液、牛奶、玉米粉优点——营养丰富、配制容易缺点？质量不稳定、选择性差；3）半合成培养基半——不纯优缺点介于前两者之间，因而使用最广。蛋白胨——动植物蛋白（大豆或动物骨粉等）经初步酶解形成的短肽（主要作氮源）酵母膏固体培养基、半固体培养基和液体培养基（1）液体培养基（“汤”）——废水也可看作是一种广义的液体培养基2、根据物理状态人工做法——(与果冻方法一样)向液体培养基中加入2％左右的琼脂，加热至100℃溶解，40℃下冷却并凝固。石花菜(红藻）→琼脂琼脂主要成份—半乳聚糖，分子量大，呈网状粘着力强，溶解分散（温度为96℃以上）条状琼脂粉末琼脂（2）固体培养基天然的固体培养基——土豆块、培养真菌的麸皮、大米、大麦等。琼脂特性：A.不能被绝大多数微生物利用、分解液化；提问：有什么好处？不作为额外碳源，干扰试验，保持固体特性B.高压灭菌结构不被破坏，且颜色透明不妨碍观察；

C.多数微生物在琼脂培养基表面生长并形成独立菌落；作用:1.纯种分离

2.计数3.菌落特征在液体培养基中加入0.5%或更低浓度的琼脂半固体培养基中可以融入少量的溶解氧，因此这种培养基常被用于培养在较低氧浓度环境下才能最佳生长的细菌。作用：1.判断呼吸类型和有无鞭毛；2.厌氧菌种的保存（3）半固体培养基基础型（普适）、加富型、选择型、鉴别型(1)基础培养基——含有一般微生物生长繁殖所需要的基本营养物质细菌用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（肉汤培养基）酵母菌马铃薯葡萄糖琼脂培养基或霉菌麦芽汁琼脂培养基3、根据培养基用途分在基础培养基里加入某些特殊营养物质，用来培养对营养要求较苛刻的异氧微生物（2）加富培养基——基础营养+特殊营养

作用：从混杂的微生物群体中分离需要的种类待选的细菌能优势生长选择性——？有两种制备思路：3.选择培养基——特殊营养需要或对化学物质的敏感性不同常用物质为染料、胆汁酸盐、金属盐类、酸、碱和抗生素。例如欲分离古细菌，培养基中通常加入青霉素（由于古细菌的细胞壁不同于普通细菌，因而不会被对破坏普通细菌细胞壁结构的青霉素杀死），古细菌就唯一分离并存活下来。胆汁酸盐——抑制革兰氏阳性菌提问：它能选择性生长那种细菌？革兰氏阴性细菌思路1：投毒物——选择性的抑制剂待选细菌有抗性专一性营养源培养法待选细菌专门需要的某种碳源或氮源例如筛选纤维素分解菌选用纤维素作为培养基中的唯一碳源；各类降解石化废水特殊有机物的细菌筛选通常是以这类有机物为培养基中的唯一碳源，将目的细菌富集筛选下来。思路2：投其所好——营养、环境因子作用：鉴别不同种类鉴别——明查分别（细菌种类）提供培养环境外还同时具有类似于“验钞机”的作用方法？鉴—加入指示剂（“紫光灯”）别—不同菌落制造不同的代谢物（“有无荧光粉”），显色不一（4）鉴别培养基——基本营养物质＋指示剂伊红美蓝培养基鉴别大肠菌群的不同种类大肠菌群的菌落特征因种不同而异。大肠埃希氏杆菌:深紫黑色带金属光泽;枸椽酸盐杆菌:紫黑色，不带或略带金属光泽;产气杆菌:淡紫红色，中心色较深副大肠杆菌:无色透明1.合适的营养自养型：由简单的无机物质组成异养型：

至少含有一种有机物质（四）培养基的配置原则粉末状硫10gKH2PO44gMgSO40.5g

CaCl20.5g(NH4)2SO40.4gFeSO40.01g

水1000mL（自来水即可）

提问：其中各组分作用是什么？碳源是什么？化能自养菌氧化硫杆菌的培养基葡萄糖0.5gK2HPO41gMgSO40.2g

NaCl5gNH4H2PO40.4g水1000mL化能异养菌:大肠杆菌培养基根据微生物种类划分的常见培养基微生物种类名称配方细菌牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl5g，H2O1000mL放线菌高氏1号培养基可溶性淀粉20g，KNO31g，K2HPO40.5g，NaCl0.5g，MgSO4·7H2O0.5g，FeSO40.01g，H2O1000mL酵母菌麦芽汁培养基干麦芽粉+水，58～65℃条件下糖化处理配制霉菌查氏培养基蔗糖30g，K2HPO41g，KCl0.5g，MgSO4·7H2O0.5g，FeSO40.01g，H2O1000mL

实际应用中应注意营养要求小范围可改变。指细菌对碳源等的种类、数量一定程度上可驯化适应（酶的诱导、易变异）2.适宜的浓度与配比(1)营养物的浓度浓度合适良好作用浓度大抑制作用浓度小不能满足需要(2)各营养物质的浓度比实际应用中应注意：“营养要平衡”碳氮磷比（C／N／P）根瘤菌：碳氮比＝11.5：1土壤微生物：碳氮比＝25：1好氧微生物：

BOD：N：P＝100：5：1厌氧微生物：BOD5：N：P＝350～500：5：1污水生物处理中：碳氮比（C／N）

为了保证污(废)水(有机固体废物）生物处理要按碳氮磷比配给营养。如酒精废水缺？；洗涤剂废水？N、P缺NP过剩先测、对比、试验验证炼油废水？N、P工业废水缺某种营养，应供给或补足生活污水不存在营养不足提问：如何知道所处理的废水中营养物供应是否比例平衡呢？注意：如果工业废水不缺营养，就切勿盲目补充！提问：为什么？过犹不及——“娇惯”细菌往往先利用这类现成的容易被吸收、利用的有机物质，而不再利用工业废水中难以吸收、利用的有机物，从而导致细菌分解特殊有机物的能力下降。

工业废水生物处理时，一般先与生活废水（含有N、P等营养）混合后再进行，这样各种营养就较为均衡了。

细菌7.0－7.5放线菌7.5－8.0

霉菌和酵母菌4.5－6.0藻类和原生动物6.5-7.53.控制pH条件

在微生物的生长和代谢过程中，由于营养物质的利用和代谢产物的形成与积累，常会改变培养基的pH值，为了维持培养基pH值的相对恒定，通常采用两种酸碱度的调节方式:内源调节

外源调节加碱液(10％NaOH)加不溶性碳酸盐加缓冲剂（K2HPO4和KH2PO4）加酸(10％HCl)根据微生物与分子氧的关系分为三类：特点：必须有氧才能生长

实验室好氧培养棉塞浅层恒温箱培养无菌空气搅拌摇床振动供氧(1)好氧微生物微好氧微生物专性好氧微生物4.氧气污水好氧生物处理中：充氧量要与微生物量及BOD5值保持一定的比例关系。如：①进水BOD5值为200～300mg/L②微生物浓度（MLSS）为2～3g/L③DO＞2mg/L。＞0.2mg/L进行好氧呼吸；<0.2mg/L进行厌氧呼吸。(2)兼性厌氧微生物

特点：有氧和无氧都能生存

(3)厌氧微生物无氧生存耐氧性厌氧微生物专性厌氧微生物不能利用氧，但氧气无害遇氧死亡

去氧气加还原剂(巯基乙酸盐、半胱氨酸）

胶塞深层培养

实验室厌氧培养低温型微生物高温型微生物

中温型微生物

藻类和原生动物：28~30℃霉菌、酵母菌和放线菌：26~28℃

5.温度根据微生物最适温度分为三类：细菌：36~37℃

通常？加水二、培养基配制微生物杀灭抑制：彻底杀灭灭菌部分杀灭消毒抑制微生物生长防腐任务3.3物品的干热灭菌技术和高压蒸汽灭菌技术灭菌：利用理化因素杀死全部微生物。

消毒：利用理化因素杀死病原微生物的营养细胞。防腐：利用理化因素抑制微生物生长繁殖。干热灭菌法干热高温灭菌法湿热灭菌法

间歇灭菌法高压蒸汽灭菌法火焰灭菌法紫外线杀菌法(一)灭菌方法1、干热法（1）干热高温灭菌法－－利用热空气灭菌。设备：电热干燥箱烘箱方法：160～170℃下维持1～2h。适宜对象：金属制品、清洁玻璃器皿和油料物质等。注意事项：a.放的物品不可有水、不能堆放太满、太紧，否则会影响温度正常上升。b.不能超过180℃，否则会导致纸张烤焦起火c.物品灭菌后应自然降温至60℃方可取出。接种工具、试管口和锥形瓶口等。灭菌工具：酒精灯适宜对象：（2）火焰灭菌法

温度灭菌时间乳糖破坏率115℃20min4.3％121℃15min32％（1）高压蒸汽灭菌法－－利用饱和蒸汽压灭菌。设备：高压蒸汽灭菌锅方法：A.0.105MPa，121℃，15-30min适合对象：耐热耐湿培养基B.0.075MPa,115℃,20-30min适合对象：含糖培养基2、湿热法a、灭菌时，应注意排尽锅内冷空气，否则锅内温度达不到实际需要的温度。锅内空气排除度

锅内实际温度

未排除空气100℃

排除2/3115℃

完全排除121℃高压蒸汽灭菌法注意事项：

抽取已灭菌的培养基，置于37℃，培养24h～48h，若无菌生长，说明灭菌彻底，可备用。c、无菌试验b、灭菌完毕，应缓慢放气减压，以免容器内液体沸腾弄湿棉塞，当压力降至零时，方可打开容器。（2）间歇灭菌法工具：蒸锅方法：100℃蒸煮15～60min37℃培养24h反复三次

A.

耐热耐湿的物品；B.不耐高温的营养物（如血清培养基）适用对象：

湿热比干热更容易杀死细菌。

原因:

水传热性能好、穿透力强。（1）杀菌机理:干扰DNA复制a.诱导DNA形成胸腺嘧啶二聚体，阻止DNA解链

b.引起核苷酸链断裂使空气中的O2变成O3（2）杀菌剂量=

照射时间Х照射强度（W）3、紫外线杀菌（4）适用对象：

无菌实验室、手术室、病房(3)紫外线杀菌特点A.穿透性差B.光复活现象C.暗复活现象A.空气消毒使用前后应将门关紧，打开紫外灯，每10－15m2

悬吊安装一支30瓦的紫外线灯，距离在1.0m处，消毒时间不少于30min，如果车间温度低于20℃或者高于40℃，湿度大于60％时应延长消毒时间。

b.注意定期检测灯管照射强度，灯管每隔两周需用酒精棉球轻轻擦拭，除去上面灰尘和油垢，以减少紫外线穿透的影响。注意事项：a.

不得直接在紫外线下操作，以免引起损伤，防止臭氧污染。C.诱变育种B.表面消毒（5）应用适宜对象：牛奶、饮料等。（二）、消毒方法1、巴氏消毒法设备：1).间歇式水煮杀菌锅2).长方形水槽3).连续式水煮设备方法：4).喷淋式连续杀菌设备1).63～66℃30min2).72~75℃15min3).85℃5min设备：

a.片式或套管式热交换器

b.蒸汽喷射型加热器方法：a.130~150℃，2~6sb.75~85℃预热4~5min→130~150℃，2~6s

在预热过程中，可使大部分的菌被杀死同时可使芽孢萌发，其后的高温瞬时加热主要杀死耐热强的芽孢菌。污染严重的鲜乳在142℃以上杀菌效果较好。

适宜对象：牛奶、饮料、果汁、酱油等液态食品。2、高温瞬时消毒3.煮沸消毒法消毒方法：100℃,

15min

加1%NaHCO3,可增强消毒效果。用具或食品等。适宜对象：适宜对象：手的消毒(1)、乙醇浓度70％－75％纯的或高浓度的乙醇，易使菌体表面凝固形成保护膜，使乙醇不易进入细胞内部，导致杀菌效果减小或全无。注意：对细菌的繁殖体有杀菌作用，对芽孢无效。4、化学消毒剂消毒(2).过氧乙酸---又称过氧醋酸，是一种广谱、高效、速效的强力杀菌剂。剂量:小于0.5％适宜对象：手的消毒原理：过滤除菌主要是利用膜的作用，是一个膜分离的过程。膜分离过程是一种被透过或被截留于膜的过程，近似于筛分过程，依据滤膜孔径的大小而达到物质分离的目的。过滤除菌就是细菌、杂质截流在膜上的过程。（三）过滤除菌——用于不耐热的物品应用:

2.酱油的澄清除菌淡酱油经超滤后,其全氮、氨基酸态氮、无盐固形物、还原糖、色素等保持率均在98%左右,菌落总数<100个/mL1.乳品的过滤除菌使鲜奶几乎保持原有风味,保质期可由原来的6～8d延长到16～24d,将巴氏杀菌和无机膜过滤相结合,生产浓缩的巴氏杀菌牛奶的过程已实现工业化。3.食醋的澄清除菌总酸保持率大于99%,浊度(NTU)从700降至0.2，菌落总数从9600个/mL降至10个/mL应用:

4.饮料的除菌采用微滤膜分离进行无菌过滤是最有效的,它可以把细菌、酵母和霉菌全部截留,而食品中的有效成分都能透过膜5.生啤酒的无菌过滤完全除去微生物;单位时间处理量大;使用期长;能加热灭菌;物理和化学稳定性好;膜中无溶出物；无啤酒成分的吸附

2.真空法：

1.低温法：3.高酸度法：泡菜。

4.化学药剂法：食品：苯甲酸（及其钾盐）、山梨酸（及其钾盐）、苯甲酸钠；二甲基延胡索酸生物标本：福尔马林溶液（四）防腐的方法衡量方法：通常以一定浓度溶液与纯水间形成的渗透压作为该溶液的渗透压提问：水将从

渗透压一方流向

渗透压的一方？低、高渗透压可影响细菌生存：(1).相同渗透压溶液中细菌细胞内水含量稳定，细菌生活得最好。渗透压:高浓度的盐或糖提高了食品的渗透压5、高渗透压提问：哪些是高渗透压溶液？细菌会发生什么现象？浓溶液；质壁分离—防腐（微生物将脱水死亡）10％的食盐或50％～70％糖可抑制大多数腐败的致病菌生长。（2）高渗透压溶液

不同的微生物对高渗透压的耐性不同：许多霉菌（青霉、曲霉等）、少数酵母菌（蜂蜜酵母、鲁氏酵母等）和细菌（如盐杆菌和黄小球菌等）可在高渗条件下旺盛生长。提问：细菌于其中会如何？如纯水外界大量水流入细菌细胞内，细胞膨胀，甚至破裂。

在微生物实验室中稀释菌液，应该用生理盐水（0.85%NaCl

）溶液.(除非稀释后马上就用的可以用无菌的蒸馏水。)（3）低渗透压溶液细菌基本上是生活在水中的生物。提问：环境中过于干燥细菌如何生存？（在不受热和其它外界因素干扰下）干燥细胞将处于长期休眠状态——用干燥法防止食物腐败（细菌滋生）如方便面、干果、肉干、葡萄干等。——用干燥法来保存细菌，如将细菌放置在干燥的沙土中可以长期保存。一旦提供潮气则会很快复活。6、干燥实训：一、干燥箱使用玻璃器皿，如试管、培养皿、三角瓶、移液管等操作步骤：适用对象：（1）待灭菌物品装箱:不要摆得太挤，不与内壁的铁板接触（2）升温:不可中途开箱门（3）恒温：160～170℃维持2h（4）降温：切断电源自然降温，70℃以下方可开箱取物实训：二、高压灭菌锅使用耐高温和潮湿的物品的灭菌，如玻璃器皿、金属器械、培养基、纱布和工作服等操作步骤：适用对象：（1）加水（2）装料、加盖：对角式均匀拧紧锅盖上的螺栓门（3）排气：排尽冷空气（4）升压、保压、降压：121℃维持20~30min切断电源,自然降温降压接近0时，方可排气开锅取物（5）灭菌检验：灭菌培养基37℃培养24h，观察是否有菌生长任务3.4样品的采集、保存、送检与分离技术（一）土壤中微生物的分布特征1．土壤是微生物生活的良好环境（1）营养（2）水分和渗透压（3）空气（4）pH值（5）温度2．土壤微生物的种类、数量及其分布（1）细菌约占土壤微生物总数的70%～90%（2）放线菌约占土壤微生物总数的5%～30%（3）真菌每克土壤中有真菌几千至几十万个。（4）藻类不到微生物总数的1%（5）原生动物每克土壤有几十个至几十万个（二）水体中微生物的分布特征1．水中微生物的种类（1）清水型水生微生物在每毫升水中一般只含几十个到几百个细菌，并以自养型种类为主。（2）腐败型水生微生物每毫升水中可达几千万个甚至几亿个，以异养菌为优势。（三）空气中微生物的分布特征空气微生物来源:飞扬的尘土飞溅的水滴人和动物的干燥脱落物口腔内的微生物空气中微生物数量的多少与环境状况有关。尘埃多，微生物的种类和数量多（四）微生物间的相互关系微生物之间的关系主要有：共生关系互生关系拮抗关系寄生关系1、共生关系——相依为命指两种生物共居在一起相互分工协作，彼此分离就不能很好地生活。

例如：地衣中的藻类（提供有机物和氧气）和霉菌（提供水分、无机营养和保护作用）。叶状地衣

叶状地衣（南极石耳）

不仅微生物间存在着共生关系，微生物与动、植物之间也存在着共生关系。根瘤菌（氮素养料）——豆科植物（分泌物，生长环境）兰科植物的种子——菌根菌杜鹃科植物的幼苗——菌根菌牛、羊、鹿、骆驼等反刍动物（以纤维素的形式提供养料、水分、无机元素、合适的pH、温度以及良好的搅拌条件和厌氧环境）——它们胃中的微生物（提供了有机酸和必需的养料）

2、互生关系——相互有利；分开也行指两种可以单独生活的生物生活在一起，通过各自的代谢活动而利于对方，或偏利于一方的生活方式。

分解纤维素的细菌——好氧的固氮菌固氮菌（提供有机氮化合物）——纤维素分解菌（提供有机酸）根际微生物——高等植物肠道正常菌群（代谢）——人体（提供良好的生存环境）菌藻互生关系示意图3、寄生关系——损人利己

指小型生物从大型的生物体内或体表获取营养进行生长、繁殖的现象。噬菌体寄生于细菌细胞内；4、拮抗关系

——强欺弱

指一种微生物在其生命活动中，产生某种代谢产物或改变环境条件，从而抑制其他微生物的生长繁殖，甚至杀死其它微生物的现象。捕食关系和偏害关系均为拮抗关系。

捕食关系——大吃小、强食弱的现象。例如：活性污泥中原生动物吞噬细菌。偏害关系——在同一环境中的不同微生物群落，对食物、DO、空间和其他共需的物质竞争，通过产生一种代谢产物使一方受抑制或杀死的关系。强欺侮弱、排除异己。

在制造泡菜、青储饲料时，乳酸杆菌产生大量乳酸，导致环境pH值下降，抑制了其它微生物的生长，这属于非特异性的拮抗作用。青霉菌产生的青霉素能抑制一些革兰氏阳性细菌，链霉菌产生的制霉菌素能够抑制酵母菌和霉菌等，这些属于特异性的拮抗关系。1.采水容器

②采样瓶的洗涤③采样瓶的灭菌:160～170℃干热灭菌2h，或用高压蒸汽灭菌器，121℃灭菌15min①采样瓶：具磨口玻塞的500mL广口瓶（一）水样的采集实训：样品采集与分离技术2.采样步骤及注意事项

(1)去氯和高浓度重金属：灭菌前按500mL采样瓶加入0.3mL10%Na2S2O3溶液(2)采集江、河、湖、库等地表水样时，可握住瓶子下部直接将已灭菌的带塞采样瓶插入水中，约距水面10～15cm处采集（3）采集一定深度的水样时，可使用单层采水器或深层采水器（4）从自来水龙头采集样品时，采水前可先将水龙头打开至最大，放水3～5min，用酒精灯火焰灼烧约3min灭菌（5）在同一采样点进行分层采样时，应自上而下进行，以免不同层次的搅扰；同一采样点与理化监测项目同时采样时，应先采集细菌学检验样品（6）采样完毕，做好记录采好的水样，应迅速运往实验室，进行细菌学检验。一般从取样到检验不宜超过2h，否则应使用10℃以下的冷藏设备保存样品，但不得超过6h。（二）水样的保存及送检（三）微生物分离技术1．斜面接种（1）点燃酒精灯（2）正确手持试管（3）接种环灼烧灭菌（4）拔管塞（5）取菌（6）接种（7）塞管塞（8）标记2．液体接种法（1）斜面接液体（2）液体接液体3．平板接种（1）斜面接平板用划线接种连续划线法分区划线法（2）液体接平板①稀释平板法②涂布平板法（3）平板接斜面4．穿刺接种法细菌总数：指lmL水样在营养琼脂培养基中，于37℃培养24h后，所生长细菌菌落的总数。细菌总数测定的意义◈可以反映水体有机污染的程度◈生活饮用水的细菌总数lmL不得超过100个任务3.5微生物的培养条件与菌落总数的计数（一）水样的测定1.自来水及生活饮用水的测定以无菌操作方法用无菌吸管吸取1mL充分混匀的水样，注入无菌平皿中，倾注入约15mL已融化并冷却至45℃-50℃的营养琼脂培养基，并立即旋转平皿，使水样与培养基充分混匀。每次检验时应做一平行接种，同时另用一个平皿只倾注营养琼脂培养基作空白对照。待冷却凝固后，包好，翻转平皿，使底面朝上，置于36℃±1℃培养箱内培养48h，进行菌落计数。算出2个平板上生长的菌落总数的平均值即为1mL水样中的细菌总数。2.水源水或其他水样的测定（三）测定步骤（二）菌落计数方法及报告方式在记下各平皿的菌落数后，应求出同稀释度的平均菌落数，供下一步计算时应用。在求同稀释度的平均数时，若其中一个平皿有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平皿作为该稀释度的平均菌落数，若片状菌落不到平皿的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，则可将此半皿计数后乘2以代表全皿菌落数，然后再求该稀释度的平均菌落数。细菌总数是以每个平皿菌落的总数或平均数(例如同一稀释度两个重复平皿的平均数)乘以稀释倍数而得来的。各种不同情况的计算方法如下：①首先选择平均菌落数在30～300之间者进行计算，当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，即以该平均菌落数乘其稀释倍数报告(见例1)。②若有两个稀释度，其平均菌落数均在30～300之间，则应按二者之比值来决定。若其比值小于2应报告两者的平均数，若大于2则报告其中较小的数值(见例2、例3)。（三）不同稀释度的选择及报告方法③若所有的稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释倍数最大的平均菌落数乘以稀释倍数报告(见例4)。④若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释倍数最小的平均菌落数乘以稀释倍数报告(见例5)。⑤若所有稀释度的平均菌落数均不在30～300之间，则以最接近300或30的平均菌落数乘稀释倍数报告（例6)。⑥菌落计数的报告：菌落数在100以内时按实有数报告；大于100时，采用二位有效数字，用10的指数来表示。在报告菌落数为“无法计数”时，应注明水样的稀释度。稀释度选择及菌落总数报告方式例次不同稀释度的平均菌落数两个稀释度菌落数之比菌落总数/CFU·mL-1报告方式/CFU·mL-110-110-210-3123456136527602890无法计算27无法计算16429527