高中生物奥赛辅导生化核酸

关于高中生物奥赛辅导生化核酸第四节核酸的性质（一）酸水解对酸的敏感性：糖苷键＞磷酸酯键嘌呤糖苷键＞嘧啶糖苷键利用酸水解可以研究核酸的碱基组成。（二）碱水解RNA的磷酸酯键对碱敏感。DNA抗碱水解。生理意义：DNA更稳定，遗传信息。RNA是DNA的信使，完成任务后迅速降解。一、核酸的水解第2页,共58页，星期六，2024年，5月（三）酶水解非特异的磷酸二酯酶：蛇毒磷酸二酯酶水解DNA（RNA）得5’-核苷酸牛脾磷酸二酯酶水解DNA（RNA）得3’-核苷酸特异的磷酸二酯酶：核酸酶第四节核酸的性质一、核酸的水解第3页,共58页，星期六，2024年，5月1、核酸酶的分类底物专一性：核糖核酸酶RNase脱氧核糖核酸酶DNase作用方式：核酸外切酶（exonuclease)、核酸内切酶(endonuclease)。单链核酸酶、双链核酸酶、杂链核酸酶磷酸二酯键的断裂方式：5’-（寡）核苷酸3’-（寡）核苷酸核酸酶第4页,共58页，星期六，2024年，5月RNaseH作用于DNA-RNA中的RNA链牛胰核糖核酸酶（pancreaticribonuclease),RNaseI最适pH：7.0-8.2产物：以3’-嘧啶核苷酸结尾的寡核苷酸，高度专一的内切酶RNaseT1耐热、耐酸产物：以3’-鸟苷酸结尾的寡核苷酸，专一性更高RNaseT2产物：以3’-腺苷酸结尾的寡核苷酸核酸酶2、RNase第5页,共58页，星期六，2024年，5月核酸酶S1作用于单链DNA部分牛胰核糖核酸酶，DNaseI切断双链或单链DNA产物：以5’-磷酸为末端的寡核苷酸DNA限制性内切酶具有非常严格的碱基序列专一性核酸酶3、DNase4、N-糖苷酶第6页,共58页，星期六，2024年，5月以限制性内切酶及连接酶进行核酸剪接GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGGCTTAAAATTCGAATTCGGCTTAAGCTTAAAATTCGGCTTAAAATTCGGCTTAAAATTCGEcoRIDNALigaseEcoRIstickyendEcoRIstickyendJuangRH(2004)BCbasics第7页,共58页，星期六，2024年，5月目标基因殖入质粒并转化宿主菌1plasmid1cell重组质粒转化宿主目标基因殖入质粒限制酶限制酶染色体目标基因重组基因细胞转化宿主菌JuangRH(2004)BCbasics第8页,共58页，星期六，2024年，5月二、

核酸的酸碱性质

P504

核酸的磷酸基具有酸性，碱基具有碱性，因此，核酸具有两性电离的性质。但核酸中磷酸基的酸性大于碱基的碱性，其等电点偏酸性。DNA的pI约为4～5，RNA的pI约为2.0～2.5，在pH7～8电泳时泳向正极。第四节核酸的性质1、碱基的解离p5052、核苷的解离P5053、核苷酸的解离P5064、核酸的滴定曲线P507第9页,共58页，星期六，2024年，5月三、

核酸的紫外吸收碱基、核苷、核苷酸和核酸在240~290nm的紫外波段有强烈的光吸收，λmax=260nm第四节核酸的性质第10页,共58页，星期六，2024年，5月1、鉴定纯度纯DNA的A260/A280应为1.8（1.65-1.85）纯RNA的A260/A280应为2.0。若溶液中含有杂蛋白或苯酚，则A260/A280比值明显降低。2、含量计算1ABS值相当于：50ug/mL双螺旋DNA

或：40ug/mL单链DNA（或RNA）或：20ug/mL寡核苷酸3、判断DNA是否变性在DNA的变性过程中，摩尔吸光系数增大（增色效应）在DNA的复性过程中，摩尔吸光系数减小（减色效应）第四节核酸的性质第11页,共58页，星期六，2024年，5月四、

核酸的变性、复性及杂交第四节核酸的性质(一)变性P508核酸双螺旋区的氢键断裂，变成单链，不涉及共价键断裂。当核酸的氢键在外界因素的影响下,发生断裂,使两条链分开,但不降解.叫核酸的变性.

第12页,共58页，星期六，2024年，5月第四节核酸的性质1、影响核酸变性的因素:1).外因:凡能破坏氢键和碱基堆积力的因素,都是核酸变性的因素.如:A热变性,B酸碱变性（pH小于4或大于11）,C有机试剂变性（尿素、盐酸胍、甲醛）等.2).内因:A.碱基的含量.(AT易变性,GC不易)B.DNA的均一性.C.碱基的顺序效应.第13页,共58页，星期六，2024年，5月1).DNA的变性现象将DNA的稀盐溶液加热到80--1000C,几分钟后,DNA将发生一系列的物理化学性质的改变(宏观表现).260nm的紫外吸收值升高.(增色效应)

比旋下降.

粘度下降.

浮力密度升高.

酸碱滴定曲线改变.

生物活性丧失.第四节核酸的性质2、DNA的热变性与Tm值第14页,共58页，星期六，2024年，5月增色效应与减色效应增色效应：DNA变性过程中，摩尔吸光系数增大。减色效应：DNA复性过程中，摩尔吸光系数减小。第四节核酸的性质第15页,共58页，星期六，2024年，5月核酸的变性与复性Garrett&Grisham(1999)Biochemistry(2e)p.373增色效应减色效应DNA的变性是爆发式的，变性作用发生在一个很窄的温度范围内。第16页,共58页，星期六，2024年，5月HyperchromicEffect核酸变性观察5070901.31.21.11.0Temperature(C)Relativeabsorbance(260nm)TmAdaptedfromVoetetal(1999)FundamentalofBiochemistryp.739DNA变性作用发生在一个很窄的温度范围内。第17页,共58页，星期六，2024年，5月2、熔解温度（Tm）：DNA的双螺旋结构失去一半时对应的温度。浓度50ug/mL时，双链DNAA260=1.00，完全变性（单链）A260=1.37当A260增加到最大增大值一半时，即1.185时，对应的温度即为Tm。DNA的Tm一般在82—95℃之间溶解温度Tm第18页,共58页，星期六，2024年，5月3、影响DNA的Tm值的因素①DNA均一性。均一性高，变性温度范围越窄，据此可分析DNA均一性。溶解温度Tm第19页,共58页，星期六，2024年，5月核酸G+C组成分越高者Tm越大7080901001.41.21.0Relativeabsorbance(260nm)Temperature(°C)Pneumococcus肺炎球菌(38%)G+CE.coli(52%)S.Marcescens粘质沙雷氏菌

(58%)M.Phlei分枝杆菌

(66%)AdaptedfromGarrett&Grisham(1999)Biochemistry(2e)p.372第20页,共58页，星期六，2024年，5月②G-C含量与Tm值成正比。测定Tm，可推知G-C含量。G-C%=（Tm-69.3）×2.44P509核酸G+C含量与Tm值成正比第21页,共58页，星期六，2024年，5月③介质中离子强度P509离子强度高，Tm高。Tm值与介质中离子强度的关系第22页,共58页，星期六，2024年，5月阳离子中和核酸的负电荷而使Tm增大60708090100110100806040200Tm(C)G+C(%)0.15MNaCl0.015MNacitrate0.01Mphosphate0.001MEDTAAdaptedfromGarrett&Grisham(1999)Biochemistry(2e)p.3723’5’5’3’第23页,共58页，星期六，2024年，5月DNA分子的复性(二)、复性

指经加热变性的DNA在适当条件下，二条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象，它是变性的一种逆转过程。热变性DNA一般经缓慢冷却后即可复性，此过程称之为退火(annealing)。第24页,共58页，星期六，2024年，5月DNA分子的复性复性机制：10-20bp成拉链热变性DNA在缓慢冷却时可以复性，快速冷却不能复性。复性速度可用Co·t衡量。Co为变性DNA原始浓度mol·L-1，t为时间，以秒表示。变性DNA在适当条件下（一般低于Tm值20~25℃），两条链重新缔合成双螺旋结构。第25页,共58页，星期六，2024年，5月核酸复性的速度与其基因组复杂度有关p51010-610-510-410-310-210-11101001K10K00.51.0Fractionreassociatedc0t(mole/L•

sec)1101021031041051061071081091010E.coliT4MS2Mousesatellite牛CalfPolyU/PolyAAdaptedfromGarrett&Grisham(1999)Biochemistry(2e)p.374复性所需时间

(长)基因组大小第26页,共58页，星期六，2024年，5月分子杂交（三）分子杂交：(hybridization)

不同来源的核酸变性后，合并在一处进行复性，这时，只要这些核酸分子的核苷酸序列含有可以形成碱基互补配对的片段，复性也会发生于不同来源的核酸链之间，即形成所谓的杂化双链，这个过程称为杂交(hybridization)。第27页,共58页，星期六，2024年，5月1、SouthernBlottingDNA样品→酶切→电泳→碱变性→转膜→固定→杂交→洗涤→放射自显影SouthernBlotting可用于DNA之间同源性分析，确定特异性DNA序列的大小和定位。(三)分子杂交分子杂交第28页,共58页，星期六，2024年，5月核酸分子间的杂交反应

hybridizationRNADNA1DNA2探針SouthernhybridizationNorthernhybridizationJuangRH(2004)BCbasics杂交可以发生于DNA与DNA之间，也可以发生于RNA与RNA之间和DNA与RNA之间。第29页,共58页，星期六，2024年，5月Northernblotting（印迹法）第30页,共58页，星期六，2024年，5月SouthernBlotting的转印Albertsetal(2002)MolecularBiologyoftheCell(4e)p.499第31页,共58页，星期六，2024年，5月取出转印纸以探针杂交呈色Albertsetal(2002)MolecularBiologyoftheCell(4e)p.499第32页,共58页，星期六，2024年，5月2、

NorthernBlotting研究对象是mRNA，探针一般是DNA。总RNA或mRNA需在变性条件下电泳（乙二醛、甲醛）3、

WesternBlotting抗原与抗体的杂交研究克隆基因表达产物、鉴定克隆株的常用技术。Northernblotting（印迹法）第33页,共58页，星期六，2024年，5月菌落转印到滤纸后以探针杂合盖上滤纸显像呈色加入探針转印中取出滤紙溶解细胞核酸变性JuangRH(2004)BCbasicsColonyhybridization第34页,共58页，星期六，2024年，5月样本

DNA每一点上涂布有已知

DNA生物芯片Schena(2000)MicroarrayBiochipTechnology,p.A31互补的

DNA会互相杂合产生信号基因芯片利用杂交反应JuangRH(2004)BCbasics第35页,共58页，星期六，2024年，5月第五节

核酸研究技术一、

核酸的分离纯化和定量尽可能保持其天然状态，防止降解和变性。条件温和，防止过酸、过碱、剧烈搅拌。抑制核酸酶。第36页,共58页，星期六，2024年，5月（一）DNA分离纯化真核DNA以核蛋白（DNP）形式存在，DNP溶于水或高盐溶液（1mol/LNaCl），但不溶于低盐溶液（0.14mol/LNaCl），据此，采用高盐提取，低盐沉淀，可将DNP与RNA核蛋白分开，提取出DNP。DNP可用水饱和的酚抽提，去除蛋白质。还可用氯仿异戊醇去除蛋白质。水相中的DNA可被0.3MNaAC-70%乙醇沉淀。一、核酸的分离纯化和定量第37页,共58页，星期六，2024年，5月（二）RNA的制备RNase的灭活：玻璃器皿：140-200°C，8小时；塑料器皿：0.1%DEPC(焦碳酸二乙酯)，37°C，过夜提取液加盐酸胍或异硫氰酸胍反应体系中加RNasin等特异的RNase抑制剂一、核酸的分离纯化和定量第38页,共58页，星期六，2024年，5月不同构象的核酸（线形、环形、超螺旋），密度和沉降速率不同，用Cs-Cl密度梯度离心可以将不同构象DNA、RNA与蛋白质区分开来。这一方法常用于质粒DNA的纯化。二、核酸的沉降特性与超速离心超螺旋DNA或第39页,共58页，星期六，2024年，5月（一）琼脂糖电泳用于大片段DNA的分离，精度低，但分离范围广影响迁移率的因素：①

核酸分子的大小，迁移率与分子量的对数成反比②凝胶浓度③

DNA的构象，超螺旋最快，环型其次，线型最慢。④

电压，不大于5V/cm染色：0.5ug/mlEBRNA的琼脂糖凝胶电泳一般要加入甲醛或戊二醛三、核酸的凝胶电泳第40页,共58页，星期六，2024年，5月第41页,共58页，星期六，2024年，5月琼脂糖电泳可以用于DNA分子量的测定三、核酸的凝胶电泳第42页,共58页，星期六，2024年，5月（二）PAGE电泳

以聚丙烯酰胺作支持物，这种凝胶的孔径比琼脂糖胶要小，所以可用于分析相对分子质量小于1000bp的DNA片段和RNA的电泳。聚丙烯酰胺凝胶强度较好，常用垂直板电泳。三、核酸的凝胶电泳第43页,共58页，星期六，2024年，5月(一)、

限制修饰系统

限制性内切酶往往与一种甲基化酶同时成对存在，构成一个限制修饰系统，甲基化酶使细菌自身的DNA带上标志，限制性内切酶专门用于降解入侵的外源DNA。限制酶的命名，如：E.coRI第一位：属名E（大写）第二、三位：种名的头两个字母小写co第四位：菌株R第五位：从该细菌中分离出来的这一类酶的编号四、限制性核酸内切酶与DNA物理图谱构建（1979年发现p504）第44页,共58页，星期六，2024年，5月同裂酶：来源不同的限制酶（名称自然不同），识别位点相同，切割位点相同，产生同样的粘性末端。

BamHI：GG↓ATCCBstI：GG↓ATCCMboI：GAT↓CSau3A：GAT↓C同尾酶：来源各异，识别的靶序列不同，但都产生相同的粘性末端。

BclI：TG↓ATCABglII：AG↓ATCA四、限制性核酸内切酶与DNA物理图谱构建第45页,共58页，星期六，2024年，5月(二)、

DNA物理图谱及构建（限制酶切图谱、DNA酶切位点图谱）在研究某一种DNA时，弄清该DNA分子有哪些限制酶切位点是很重要的。建立物理图谱是进一步分析此DNA的基础。四、限制性核酸内切酶与DNA物理图谱构建第46页,共58页，星期六，2024年，5月（一）双脱氧终止法英国Sanger1955确定牛胰岛素结构，1958

获诺贝尔化学奖。1975设计出DNA测序法，1980

获诺贝尔化学奖。合成一段与待测DNA序列互补的DNA片段群。五、

DNA序列分析第47页,共58页，星期六，2024年，5月核酸测序原理PolyacrylamideGelElectrophoresisATC32PAT32PA32PTAGCTACGATCG32PATCGA32PATCGAT32PATCGATC32PATCGATCG32PATCGATCGA32PATCGATCGAT32P凝胶电泳泳可以分开各种不同长度的核酸，在电泳胶片依序排开︰但这样的图谱不能判别出各核酸端点的核苷酸种类若能把尾端核苷酸相同的片段提出，跑在同一行，由比较这样的四行，即可读出序列。JuangRH(2004)BCbasics第48页,共58页，星期六，2024年，5月Sanger'sMethod:Maxam-Gilbert'sMethod:做出不同长短核酸的方法32P32PATCGATCG32PATCGATATCGATATCGTAGCTAGCTATAGCTAGCTATAGCTAGCTAATCGA32PSpecificReactiontoG

ATCGSTOPA中止合成继续合成生物合成法化学法Templateor无放射性片段不能显像32PA,T,C,GAAnalogue破坏→断裂破坏→断裂ATCGATCGAT产生各种片段JuangRH(2004)BCbasics第49页,共58页，星期六，2024年，5月PhosphodiesterbondP

R

P

R

PRPRPRPROH5’3’13’5’A123456APO4

2-H3’5’2Hdideoxynuceotide中止ddNTP生物合成核酸测序法的反应

可正常连结无法再接下去JuangRH(2004)BCbasics第50页,共58页，星期六，2024年，5月DNA序列分析仪：四色荧光基团标记的dNTP第51