微生物基因组和转录组学研究

微生物基因组

和转录组学研究微生物基因组研究的意义微生物基因组研究概况微生物基因组的特点微生物基因组学微生物基因组学研究意义美国启动“国家微生物组计划”，它是继脑计划、精准医学、抗癌“登月”之后的又一个重大科研计划。微生物存在于人体，影响着人类健康。“肠道菌群”与肥胖、癌症、糖尿病等疾病密切相关微生物存在于环境中，和工农业生产、气候变化等环境问题密切相关低成本高通量测序技术的发展、数据分析的生物信息学工具的革新等

解决多样化生态系统中微生物组成；开发分析微生物的工具，培养专业化的微生物组相关人才中华民族人口众多，遍布世界各地，不同的生活方式和饮食习惯，是人体微生物组的多样化资源微生物基因组研究概况年限 事件1994年 美国DOE启动MGP1995年 《Science》发表了第一株细菌-流感嗜血杆菌全基因组1995年 发表了集胞藻菌株PCC6803的测序和注释1996年 《Science》发表了第一个完成的古细菌-詹氏甲烷球菌全基因组序列1996年 酵母基因组序列发表1997年 大肠杆菌K-12基因组序列发表原核生物基因组的大小原核生物基因组的编码序列(CDS/ORF)原核生物染色体结构GC含量重复序列DNA链组成的非对称性微生物基因组的特点微生物基因组的特点类别特征染色体结构多为一条环状闭合双链DNA基因组大小从0.16-13Mb编码序列占基因组总长度的90%，平均为1Kb左右GC含量16.6%-74.9%DNA链组成的非对称分布GCskew、ATskew、基因方向性偏好、密码子使用偏好CircularrepresentationofthegenomeofT.tengcongensisMB4原核生物基因组的编码序列占原核生物基因组总序列的90％基因的平均大小为1kbORF（OpenReadingFrame）原核生物基因组的编码序列－－

不同生物编码序列的比较Organism Genome(kb)ORFs ORFsizeCodingSequence(%)Buchnerasp 640583 988 90Aquifexaeolicus1,551 1,512 956 93Saccharomycescerevisiae12,069 6,294 1,092 57Schizosaccharomycespombe14,0004,820 2,033 70Caenorhabditiselegans97,000 19,099 1,311 27Arabidopsisthaliana115,428 25,498 46029Homosapiens3,000,000 30,000 1,340 <2原核生物基因组的编码序列－－

核生物（高温菌）基因组的内含子SulfolobussolfataricusP2：18个tRNA基因含有单个内含子一个胱氨酸tRNA基因含有2个内含子A.

pernix

tRNA基因中发现14个内含子Staphylothermusmarinus和运动脱硫球菌23SrRNA基因中也发现内含子

染色体结构大多数原核生物：一条环状闭合双链DNABrucellasuis1330：两条环状闭合双链DNA2,107,792bp(ChrI)

1,207,381

bp(ChrII)Vibriocholerae:两条环状闭合双链DNA2,961,146bp(ChrI)1,072,314bp(ChrII)

BorreliaburgdorferiB31：910,725bp（linearChromosome）21linearandcircularplasmidsTreponemapallidum：一条环状闭合双链DNA1,138,006bpGC含量原核生物基因组GC含量为：16.6-74.9%嗜温菌基因组GC含量与rRNA、tRNA的GC含量成正比嗜热菌rRNA、tRNA的GC含量与基因组GC含量不成正比，但与OGT（最适生长温度）成正比tRNAGC含量总是大于rRNA的GC含量嗜温菌基因组G+Ccontent(%)OrganismGenomerRNAtRNAXfas 52.7 53.1 59.8Tpal 52.8 53.1 57.2

Mlep 57.8 55.7 61.6

Atum 59.4 54.6 58.4Smel 62.754.5 61.5Mlot 62.7 56.360.5Mtub 65.6 58.062.0Paer 66.653.1 60.1Drad 67.056.5 58.8Ccre 67.255.0 61.2Hbsp 67.9 58.1 62.4linearregression 0.88 0.80嗜热菌最适生长温度（OGT）

与G＋C含量的关系Organism OGT(℃)Genome rRNA tRNAPabyssi 103 0.45 0.67 0.70Pyro 98 0.42 0.63 0.71Aero 95 0.56 0.68 0.73Mjan 85 0.31 0.61 0.66Aquae 85 0.43 0.65 0.68Aful 83 0.49 0.63 0.68Ssol 80 0.36 0.62 0.67Tmar 80 0.46 0.63 0.65Tten 75 0.38 0.59 0.60Mthe 65 0.50 0.57 0.62Tvol 60 0.40 0.53 0.61Tacid 59 0.46 0.53 0.61linearregression0.010.920.90基因组非编码序列的注释非编码区的注释各类重复序列基因表达的调控序列信号序列等DNA链组成的非对称性－

GC分布不对称（GCskew）

AT分布不对称（ATskew）

前导链含有较多的G（A）而后随链含有较多的C（T）

计算公式为（nG-nC）/（nG+nC）（nA-nT）/（nA+nT）累计skew（cumulativeskew)用于复制起点和终点的定位GCskewofT.tengcongensisgenomeDNA链组成的非对称性（真细菌）－

基因方向性偏好基因方向性偏好（geneorientationbias）

先导链上编码的基因总是多于后随链JeanR.LobryMicrobiologyTodayVol26DNA链组成的非对称性－

码子使用偏好（codonusagebias）

先导链和后随链密码子的不同在先导链，以G或T开头或结尾的密码子显著地多于后随链，常见的有GTG、GCG和GAG在后随链以C或A开头或结尾的密码子多于先导链，如CTC、GCC、CCC、ATC和ACC

DNA链组成的非对称性－

基因密度和密码子使用的差别

高度表达基因:核蛋白体蛋白基因，与翻译和转录有关的因子基因，分子伴侣基因和与主要的能量代谢相关的基因大多编码于前导链通常都有密码子偏好(核蛋白体蛋白基因密码子的第三位多为G)快速生长的细菌（大肠杆菌、霍乱弧菌、枯草芽孢杆菌和流感嗜血杆菌）

主要的糖酵解和三羧酸循环基因为高度表达基因产甲烷菌，与甲烷代谢有关的基因为高度表达基因高度表达基因:那些在密码子使用上与一般基因相差很大，与核蛋白体蛋白基因，翻译和转录相关基因，伴侣-降解蛋白基因等在密码子使用上高度相似的基因为高度表达基因。为什么要进行新物种的基因组测序？物种重要性及其测序必要性

模式生物；病原性；经济性状；进化地位1.基因组测序，需利用拼接，基因组注释(RNA，蛋白质和重复序列等)；2.关键性状的遗传因素(功能基因组学确定性状决定的基因或基因群)；3.比较基因组学分析--------进化地位，性状产生和进化的基因组线索等GC含量和组成重复序列类型和分布基因结构和染色体分布基因有无和数目结构域数目和组成基因家族数目和组成代谢途径有无和冗余性调控基因类型和复杂度测序物种近缘或性状相关物种基因和性状关联信息库比较基因组学分析微生物基因组研究内容细菌

研究内容

代表菌株病原菌

毒力因子、致病岛、耐药基因、耐药机制以及与寄主的关系等

肺炎链球菌、致病性大肠杆菌、沙门氏菌等极端环境生长的细菌

极端环境下的生存机制，如嗜热菌的热稳定性

詹氏甲烷球菌、热自养甲烷杆菌、甲烷嗜热菌、腾冲嗜热菌等工业和环境有影响的细菌CO2固定、固氮、硫氧化和氢代谢等

单细胞蓝细菌、丝状蓝细菌、原绿藻等基因组从头测序线路图待测序物种生物学特征遗传基础

进化地位测序方案制定序列拼接评价序列分析序列发布延伸研究文章价值评估、构思和写作微生物测序及分析流程图27测序平台的选择长度长精度高时耗短花费少测序技术长度精度时耗花费一代长（~1kb）高（99.99%）长高二代（Illumina）短（30~300bp）高（99.9%）短*1~11天/run低330~650￥/Gb三代（PacBio）长（10~15kb）低（87%）短**<=4h/run高5,000~10,000￥/Gb光学图谱：BioNano,OpGen注：*Hiseq30001个run产出600~750Gb

**PacBio1个run产出500~1000Mb微生物基因组测序策略

-高通量测序技术长reads测序（PacBio/Miseq）Hiseq短reads测序组合长reads和短reads测序Sanger法finish基因组拼接Genome

Res.

2010Feb;20(2):265-72Platanus(高杂合)SOAPdenovoABySSALLPATHS-LGFinishing阶段Finishing阶段Finishing阶段多重PCR结果，引自TettelinH.等文章

Finishing阶段短片段文库构建填补二级结构区示意图，摘自AmandaA等文章

Finishing阶段

基于转座子技术来完成重复序列区的测序，摘自ScottE等文章

分析流程的开发和固定常用数据库列表及其更新检测制度

数据分析要求：与统计检验和生物学问题紧密结合,一站式解决问题，方便文章写作；详尽动态可追溯数据库；常用软件列表及其更新检测制度固定流程要求：尽量自动化，傻瓜也能用，包含精炼的输入输出样式；基础软件版本信息，详细使用说明(使用流程的数据前提)；结果说明，可能出错的检查点是什么；内置评估脚本或策略说明流程开发方式：广泛调研，集思广益，以完成项目为先期目标(不完美但实用)基础软件的选择：最权威(引用)作者，横向比较文章，最经典文章，自行横向比较，公共论坛相关专业杂志浏览，相关文章或信息公开制度专业数据分析软件序列拼接组装:Newbler,AMOScmp,Velvet,Phred/Phrap/Consed,Oligo6复制起始位点:

ori-finder+GCskew基因注释:

Glimmer,GenemarkS,Prodigal,BLAST基因起始位点：ZCURVE翻译起始位点：GS-FindertRNA:

tRNAscan-SErRNA:RNAmmerSmallRNA:Rfam重复序列:TandemrepeatFinder,ISfinderCRISPR序列：CRISPRfinder数据分析软件Prophages:ProphagefinderVirulence-associatedfactors:VFDBdatabaseSignalpeptides:SignalP跨膜结构：TMHMMOperon:OperonDBGenomeisland:IslandViewer,MobilomeFINDER致病岛：PAIDB膜转运蛋白:TCDB抗菌素抗性基因:ARDB可变遗传因子:

ACLAME必需基因：DEGdatabase数据分析软件Overlap基因、假基因:MciobialGenomeSubmissionCheck功能注释

:COG,KEGG进化树:ClustalW,CVTree比较基因组分析:

Mauve,MUMmer,ACT,MicrobesOnline,mGenomeSubtracton,xBASE

Thegenernalfeature

ofStreptococcusparasangunis

StrainFW213Genomesize(bp)

2,171,609G+Ccontent(%)41.62AverageCDSlength(bp)

932Proteincoding

2059Proteinwithknownorpredictedfuction1496(72.7%)Conservedhypotheticalproteins461(22.4%)

Hypotheticalproteins102(4.9%)tRNAs61rRNAoperons

4Thegenernalfeature

ofStreptococcusparasangunis

StrainFW213副血链球菌比对结果蛋白质数据库比对最相似基因数分布基因组名称最相似的基因数血链球菌（StreptococcussanguinisSK36）557肺炎链球菌（Streptococcuspneumoniae）

552戈登链球菌（Streptococcusgordoniistr.Challissubstr.CH1）233嗜热链球菌（Streptococcusthermophilus）149猪链球菌（Streptococcussuis）68变型链球菌（StreptococcusmutansUA159）42无乳链球菌（Streptococcusagalactiae）31化脓链球菌（Streptococcuspyogenes）21比较基因组分析

比较基因组分析进化分析毒力基因抗药性基因组岛(fwisland)比较基因组分析-基因组岛FWislandPosition(nt)GCcontent(%)PutativeFunctions11,098,448-1,148,93534.86SalivaricinBandnisinproduction21,861,779-1,896,40535.96bacterocinproduction31,940,974-1,964,80933.63Fap1productionandfimbriaematuration42,048,864-2,07821438.2EPSproduction5252,266-263,53336.94adcoperon代谢途径基因组水平揭示细菌耐酸和产酸的机理

微生物转录组学研究微生物转录组研究内容基因注释校正：readscoverage基因表达：RPKM操纵子鉴定：TSS,readscoverage转录起始位点(TSS)鉴定：readscoverage新基因鉴定：没有注释但是表达的区域smallRNA分析识别调控因子目标基因微生物转录组研究内容Naturereviews.Genetics,Vol.11,No.1

微生物转录组-mRNAenrichedmethodsNaturereviews.Genetics,Vol.11,No.1

连接SOLiDRNA接头，逆转录并用RNaseH处理，PCR扩增，胶回收（120-180bp）界定转录单元转录单元在四个不同时期变化纠正基因结构预测错误DEGseq方法鉴定时期特异表达和差异表达基因完善基因组精确注释SOLiD50nt测序，序列mapping到细菌基因组，分析界定转录起始位点发现新转录本识别UTR区域鉴定不同时期特异表达和差异表达的基因，寻找潜在的致病基因、毒力基因等原核微生物转录单元结构和表达时空性问题以及基因表达调控的复杂性不同时期基因表达谱提取细菌TotalRNARNaseⅢ处理RNA样品，胶回收（50-100bp）碱性磷酸酶（BAP）去除RNA5’端单磷酸基团，烟草酸焦磷酸酯（TAP）处理RNA5’端三磷酸基团，暴露出新5’单磷酸基团去除核糖体RNA连接SOLiDRNA接头，逆转录并用RNaseH处理，PCR扩增，胶回收（120-180bp）SOLiD50nt测序，序列mapping到细菌基因组上，计算基因平均序列覆盖度RPKM-genee