广西地方标准《芒果品种鉴定技术规程SSR分子标记法》编制说明

广西地方标准《芒果品种鉴定技术规程SSR分子标记法》

编制说明（征求意见稿）

一、制定意义及任务来源

1目的意义

目前，通过分子生物学和生物信息学相结合的方法在基因水平对种质资源生物多样性进行鉴定已经

成为作物学领域研究热点。2015年4月，农业部印发《农作物品种DNA身份鉴定体系构建实施方案》

中指出“现代种业是国家战略性、基础性核心产业，品种创新是现代种业发展的核心，品种保护与管理

是品种创新的必要保障。目前，生物技术的快速发展，移动互联、大数据引发的产业变革，为品种管理

向田间表型身份鉴定与室内基因型（DNA,即脱氧核糖核酸）身份鉴定相结合的方向发展提供了有力的

技术支撑”。因此构建品种DNA身份鉴定体系是加强种子管理、保障市场公平竞争、保护农民合法权益、

提升品种创新能力和推进种业信息化发展的需要。

分子标记鉴定是从DNA水平直接反映品种或亲子间的差异，不受植物发育阶段、组织器官、季节、

环境和表达等条件的限制，同时DNA标记数量大、多态性丰富等诸多特点，现已在品种鉴定、图谱构建、

基因定位等研究中广泛应用。分子标记技术之一SSR即简单重复序列（SimpleSequenceRepeat）或微卫

星DNA（MicrosatelliteDNA）O它通常是指以2~5个核甘酸为单位的多次串联重复DNA序列，长度大

多在100~200bp。SSR在基因组中分布广泛，由于重复次数的不同而引起不同材料间的差异，通常表现

为共显性。SSR两端有一段相对保守的序列，根据保守序列设计引物进行PCR扩增就可获得SSR片段。

由于SSR分布广泛，具有多态性好、表现为共显性、对DNA质量要求低且用量少的诸多特点，己经广泛

应用于植物遗传多样性分析、杂种鉴定、指纹图谱构建、基因定位等方面。可以用于植物品种权精准授

权、打假与维权，为《种子法》的实施提供了可靠的技术手段。

芒果（MangiferaindicaL.）,漆树科，杞果属。果皮颜色有红中带黄、黄中带青、青中带黄、纯青色

等。果肉为黄色，鲜美多汁，有浓郁的芳香气味。内部有一粒种子，种子为扁平形。素有“热带果王”

之美誉，是世界上著名的热带水果，据世界粮农组织（FAO）统计，2016年全世界芒果实际收获面积和

产量分别为9616.6万亩和5127.9万吨；芒果亦是我国重要的热带水果之一，我国主要种植地区为广东、

广西、海南、云南、福建和台湾等地，5-9月为盛产期。在面积上仅次于香蕉、荔枝和龙眼，居第四位，

据农业部南亚办数据显示，2019年全国芒果种植面积达484.2万亩，产量278.2万吨（台湾未计入），产

值190.3亿元。2015年，广西芒果产量超过海南成为最大的芒果产地，居全国首位。2020年广西芒果果

园面积153.93万亩，产量79.81万吨，产值50.7亿元。广西百色与海南、攀枝花并称我国三大芒果之乡，

百色市是我国最大的芒果生产基地，近年来百色为广西芒果贡献了大部分产量，芒果产业已成为当地农

业支柱产业之一，是当地农民收入的主要来源。

广西芒果品种主要有台农1号芒、金煌芒、红象牙芒、桂热芒82号、桂七芒、贵妃芒、桂热芒10

号、凯特芒、新世纪芒等29个品种。单从形态上鉴定存在一定困难，这就给芒果品种的选育、生产、经

营和使用等方面造成不同程度的困扰，同时也给种子管理部门带来一定的挑战。我国已出台了一系列主

要农作物品种的SSR分子标记鉴定行业标准和地方标准，而目前尚无利用SSR标记技术鉴定芒果品种真

伪的方法标准。制定相应的广西地方标准，规范利用SSR标记技术鉴定芒果品种真实性，对品种管理、

质量监控等方面具有重要意义，且对杂种优势群的划分、种质创新及新品种的选育等具有指导意义。

2任务来源

2018年由广西检验检疫标准化技术委员会提出的《芒果品种鉴定技术规程SSR分子标记法》的制定

计划，2018年广西壮族自治区质量技术监督局在关于下达《2018年第一批广西地方标准制定项目计划的

通知》附件文中批准将其列入2018年第一批广西地方标准制定项目计划(序号：2018-0114),由广西益谱

检测技术有限公司、广西出入境检验检疫局技术中心、南宁维尔凯生物科技有限公司等主要负责起草该

地方标准的制定任务。

二、工作概述

1国内外相关研究

松果(Mango/Mangi于eraindicaL.),别名芒果、檬果、望果、济果、闷果、蜜望子、庵波罗果等，为

漆树科CAnacardiaceae)杞果属(Mangifera)植物，常绿果树，有"热带果王"之美誉，世界五大名果

之一。由于忙果从起源到驯化的过程复杂、不同地区之间引种、地方品种没有确切的科学名称等，近年

来，我国各地科研工作者在种质资源调查和收集研究时，大多都局限于某一地区，各自从不同的角度对

忙果进行了种下分类，同一个品种在不同省份的参试和审定的进程往往也不一致，同一品种在不同省份

通过审定后该品种的标准样品存在差异，另外，在多个省份审定的情况下，不同单位对同一品种的不同

命名，还有窃用他人品种后换名审定的，从而导致一定数量上的仿冒雷同，品种间亲缘关系不明确，而

且从形态特征上很难将其准确归类，给枯果品种管理带来一定的混乱。因此，为了更好的保护现有松果

的品种权和新品种的鉴定，应坚持品种命名的唯一性原则，需要建立起一种快速、准确、可靠、高效的

忙果种质资源鉴定方法，而传统鉴定评价方法，都有一定的局限性。目前世界上约有杞果品种1000多

个，我国约有200个松果品种或品系。杞果具有丰富的遗传多样性，果实的大小、形状、色泽、纤维多

少、核大小等是区别枯果品种的主要依据，但秋果的品种、品系很多，过去多用实生苗繁殖，产生了许

多自然杂交种，新的品种又不断地被人工培育出来，由于存在饰变和观察标准不同，依据植物学性状难

以对枯果资源进行准确分类，导致同物异名、同名异物和资源重复保存等现象严重。

M.T.Wahdan等利用SSR标记对42对引物进行了筛选，其中36对引物具有可重复的多态性DNA扩

增模式。在这两个品种的水果中，60.7%的得分片段被认为是假定的基因型特异性标记。多态信息含量

(P/C)在0.25~0.75之间，平均为0.51。Hania和Ami品种的水果的杂合度分别为0.68和0.53。通过对

这36对引物的条带分析，可以区分出不同的品种的水果，说明利用SSR引物进行PCR是一种有效的基

因型鉴定方法，可以利用DNA指纹图谱描述和鉴定两个埃及芒果新品系的园艺初步研究(Preliminary

HorticulturalStudiesToDescribeAndIdentifyOfTwoNewEgyptianMangoStrainsUsingDNAFingerprint.?；

A.Sennhenn等用19个简单序列重复标记对38棵芒果干叶片进行分子分类，研究肯尼亚东部和中部芒果

地方品种的形态和分子特征。利用Nei's遗传距离和邻居连接方法建立了芒果样品间的遗传亲缘关系树

状图。形态学鉴定得出6个不同的聚类(7de"颂ofmango(MangiferaindicaL.)landracesfromEastern

andCentralKenyausingamorphologicalandmolecularapproach)；ManalEidt等采用-简单序列重复(SSRs)

技术对25个埃及芒果品种的遗传变异程度进行了分析，并建立了指纹图谱。根据35个SSR标记的可重

复性、可分离性和品种间的分离能力，选择了35个SSR标记。35个SSR位点产生219个多态性高的等

位基因(约100%)。通过多态位点百分比、观察到的等位基因数、有效等位基因数、观察到的杂合度、预

期杂合度、固定指数和基因流等参数，计算了栽培种质的等位基因初变异率和遗传基础(Ejficiency

ParametersofSSRMarkersforCharacterizationofSomeMangoCultivarsandTheirSuitabilityinMolecular

Bar-codingSSR)。

石胜友，张燕梅，武红霞等采用SSR标记方法，对来自7个国家的36份松果品种进行了遗传相似

性分析，目的是为忙果育种亲本合理选配、现有国外种质的充分发掘利用提供科学依据；王静毅等人应

用SSR技术对广西主要柱果资源遗传关系进行SSR分析，对48个枯果品种(系)的遗传关系进行了检

测。广西主要松果资源品种间的遗传相似系数在0.4559~0.9412之间，平均为0.7053,以桂热枯06-3号

与桂热枯06-5号两者之间的相似系数最小，而Keitt与红凯特松及玉文杞与蜜桃忙之间相似系数最大。

UPGMA聚类分析将48个品种分为5大类群。聚类结果表明，在分子水平上，杞果品种间的亲缘关系

与胚性无直接关系；且广西本地松果品种(系)多是象牙机、青皮机、吕宋忙或秋枯等的杂交子代或实生后

代。芒果种质资源真伪鉴定的相关文献资料有：

1、王静毅等.广西主要忙果资源遗传关系的SSR分析[J].热带作物学2009,30(9):1301-1307；

2、石胜友，张燕梅.武红霞，等.36个柿果引进品种的遗传相似性研究[几果树学报2010,27(6):914-917；

3、黄丽芳，雷新涛,姚全胜，等.芒果SSR-PCR反应体系的优化[J].热带作物学2010,31(3):410-414；

4、黄丽芳，闫林，范睿，等人.芒果实生资源遗传多样性的SSR分析[J].热带作物学2011,32(10):1828-1832；

5、罗纯，武红霞,姚全胜，等人.芒果转录组中SSR位点信息分析与引物筛选[J].热带作物学报

2015,36(7):1261-1266;

6、覃昱茗，张宇，黄国弟，等.忙果SC-SSR分子标记反应体系的建立与优化[J].农业研究与应用，2021,34

(3)：37-43.

7、王明，应东山,王琴飞，等.我国芒果主栽品种遗传多样性分析及指纹图谱构建[J].南方农业学报Journalof

SouthernAgriculture2015,46(7):1154-1159;

8、闫慧清，刘泽标,吉海旺，等.芒果EST-SSR位点分析及引物开发[J].分子植物育种,2020,18(11)

9、周立，罗聪，何堂熹，等.基于EST-SSR标记的芒果品种遗传多样性与亲缘关系分析[J].分子植物育种.

2020,18(11)

10>PreliminaryHorticulturalStudiesToDescribeAndIdentifyOfTwoNewEgyptianMangoStrainsUsing

DNAFingerprint(利用DNA指纹图谱描述和鉴定两个埃及芒果新品系的园艺初步研究)[J].Journalof

AmericanScience,2011,7(2):641-650;

11、A.SennhenneK.Prinz*J.Gebauer*,A.Whitbread•R.Jamnadass•K.Kehlenbeck.Identificationofmango

(MangiferaindicaL.)landracesfromEasternandCentralKenyausingamorphologicalandmolecular

approach(肯尼亚东部和中部芒果地方品种的形态学和分子鉴定)[J].GenetResourCropEvol,2014,61:7-22.

12、ManalEid,M.A.Hussein.EfficiencyParametersofSSRMarkersforCharacterizationofSomeMango

CultivarsandTheirSuitabilityinMolecularBar-codingSSR(标记在芒果品种鉴定中的有效性参数及其在分

子条形码中的适用性)[J].NewYorkScienceJournal2017;10(8):68-76.

上述这引些研究都表明：SSR标记与毛细管凝胶电泳相结合的分子标记技术可以鉴定芒果品种，可

为芒果的遗传分析、指纹图谱构建、杂交效率评定等提供可靠、快速的方法。

2标准起草的主要工作过程

2.1引物的来源

本技术规范编制过程中使用的38对SSR引物主要来源于中国热带农业科学院南亚热带作物研究所、

广西大学农学院、农业部热带果树生物学重点实验室等科研院所和高校发表的文章中所使用的，以及查

阅其它文献上使用的芒果基因组序列引物。

2.2芒果品种类型的收集

本实验收集了20个芒果品种，分别是桂热芒07-2号、桂热芒07-3号、桂热芒08-10号、桂热芒10-1

号、桂热芒16-1号、桂热芒285号、桂热芒290号、三年芒、PULMER、安宁红芒、金煌芒、桂热芒10

号、圣心、桂热芒82号、桂热芒60号、桂热芒4号、泰国芒14号、桂热芒08-6号、台农、桂七，其主

要来源于广西壮族自治区亚热带作物研究所芒果种质资源圃种植基地(南宁市邕武路)。

2.3技术路线与实验

选取20个广西区内种植的不同芒果品种。用筛选出的38对SSR引物进行PCR扩增，用聚丙烯酰胺

凝胶电泳检测，对SSR引物的扩增稳定性及多态性进行分析，并采用毛细管电泳对扩增产物进行同步分

析验证。

根据峰图简单易读取、多态性高、扩增稳定性高、染色体上分布均匀的原则，最终确定了38对核心

引物用于芒果品种鉴定。

2.4技术验证

经广西益谱检测技术有限公司、广西作物遗传改良生物技术重点开放实验室和南宁国拓生物科技

有限公司等三家单位，对技术规程的可操作性和检测数据的可重现性进行了验证。其中广西益谱检测技

术有限公司对20个广西区内种植的不同芒果品种的38对SSR引物的PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶

电泳检测验证；6个广西区内种植的不同芒果品种的6对SSR引物的PCR扩增产物进行毛细管电泳检测

验证。广西作物遗传改良生物技术重点开放实验室和南宁国拓生物科技有限公司分别对6个广西区内种

植的不同芒果品种的38对SSR引物的PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测验证;6个广西区内种

植的不同芒果品种的6对SSR引物的PCR扩增产物进行毛细管电泳检测验证。经验证，《芒果品种鉴定

技术规程SSR分子标记法》技术规程中的DNA提取、PCR扩增及产物检测方法具有可操作性，按照技

术规程中的聚丙烯酰胺凝胶电泳条带明显，清晰可辩；毛细管电泳检测方法中扩增的PCR产物均能获得

清晰、稳定的主峰，且易于识别。

三、标准编制原则和标准的主要内容

1标准编制原则

规范性原则：本技术规范的制定符合法律法规，符合有关标准规范的要求，包括GB/T1.1-2020《标

准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》、NY/T2594《植物品种鉴定DNA分子标记

法总则》、NY/T2440-2013《植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南芒果》、GB/T6682《分析实

验室用水规格和试验方法》。

适用性原则：本规程的全部内容具有可操作性。

统一性原则：本规程与现行相关标准协调统一，不发生冲突。

先进性原则：本规程采用目前国际国内外品种鉴定领域均认可的、成熟的SSR标记技术，以非变性聚

丙烯酰胺凝胶电泳平台为主，兼顾毛细管电泳检测平台的芒果品种鉴定技术，与田间小区鉴定方法对比,

该方法的先进性在于不受环境影响和季节约束，检验周期短•

2标准主要内容

标准编写主要内容包括样品处理、聚合酶链式反应法（PCR）,聚丙烯酰胺凝胶电泳、毛细管电泳操

作过程以及结果判定，适用于芒果种质资源真伪的检测。

标准规程编制的过程主要进行了以下试验和工作：

2.1原理

不同品种芒果的遗传组成不同，其基因组（DNA）中SSR的重复次数存在差异，根据SSR的差异，通

过PCR扩增及电泳技术可以鉴定芒果品种。

2.2样品来源

样品采自广西壮族自治区亚热带作物研究所芒果种质资源圃种植基地(南宁市邕武路)的芒果叶片、

2.3仪器

电子天平、高速冷冻离心机、水浴锅、PCR扩增仪、垂直板电泳系统、毛细管电泳仪、凝胶成像系

统、胶片观察灯等。

2.4试剂

液氮、无水乙醇、三氯甲烷、甲醛、三羟甲基氨基甲烷、DNA分子量标准、2XTaqPlusPCR预混

试剂、40%丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺溶液、氯化钠、氢氧化钠、硝酸银、硼酸、过硫酸钱、十六烷基三

甲基澳化镀、乙二胺四乙酸二钠、四甲基乙二胺、琼脂糖、去离子甲酰胺、DNA分析仪用丙烯酰胺胶液、

DNA分析仪用LIZ500分子量内标、DNA分析仪用电泳缓冲液、DNA分析仪用光谱校准基质。

2.5SSR引物

引物序列见表1

表1引物编号及引物扩增信息

序条带大小引物退火温度

引物名称引物序列(5'-3')

号(bp)(℃)

正向：CTTCCTTTCTCTCATCACTTCCA

1mangoESll148-24855反向：CTTCAATAGTAGCCCCATCACTG

正向：CAGTAACTACTACCACCGCAACC

2mangoES24157-27055

反向：ATATTCTCGCTCTCGTTGTTTTG

正向：TCCATTTTTGACAAATCTCCACT

3mangoES35156-24655

反向：TAGCCTTGAATTCCTCAAACAAA

正向：GGTTGTTATCGTCGTTATTGTGG

4mangoES39143-16355

反向：CGGAAAATGTTCGACTTGTAACT

正向：GGGACATTGACTTAACAGCTTTC

5mangoES40144-24455

反向：CTTCTGCCTGAATGTACTGGACT

正向：CCTGTGCTTACCACCCATATTAG

6mangoES69150-21055

反向：AAAGATTGCAAGTCTGAGCAAAA

正向：TGATGAGAATGAACAAGCAGCTA

7mangoES71125-18055

反向：TATCTGCAGTAACAGCACTCAGC

正向：CGGGTAAACCCACTATGTATTCC

8mangoES126143-20055

反向：TGGTGGTGGTAAAAAGAAGAAAA

正向：TCGAGAGCTACTCTTTATCGGAA

9mangoES170150-15855

反向：AATTAAGCGTGCAAACCTGTAGA

正向：TATCATCAGAACTACCGCCATTT

10mangoES172146-19655

反向：CTCTTTTCTTCGCTGTGTTTTGT

正向：ATTATCCCTATAATGCCCTAT

11EST14175-29050

反向：CTCGGTTAACCTTTGACTAC

正向：AGGACATCTGTGACCAAGAGC

12MCR55170-22058

反向：TTCCCACCCACAACTCCAAC

正向：TGTCTTTCAGCTTCACCGCT

13MCR130250-26058

反向：CGCAGTGGAGAGTTGTTGTG

正向：CGGGACCATGTCACCAGAAA

14MCR220250-51058

反向：GGCGAATGCGTAGTCAGAGA

正向：ATGGAGACTAGAATGTACAGAG

15Lmmal205-25550

反向：ATTAAATCTCGTCCACAAGT

正向：AGATTTAAAGCTCAAGAAAAA

16Lmma4240-38047

反向：AAAGACTAATGTGTTTCCTTC

表1引物编号及引物扩增信息(续)

序条带大小引物退火温度

引物名称引物序列(5,-3，)

号(bp)(℃)

正向：AGAATAAGCTGATACTCACAC

17Lmma5280-39047

反向：TAACAAATATCTAATTGACAGG

正向：ATATCTCAGGCTTCGAATGA

18Lmma6105-20550

反向：TATTAATTTTCACAGACTATGTTCA

正向：ATTTAACTCTTCAACTTTCAAC

19Lmma7210-25050

反向：AGATTTAGTTTTGATTATGGAG

正向：CATGGAGTTGTGATACCTAC

20Lmma8260-36050

反向：CAGAGTTAGCCATATAGAGTG

正向：TTGCAACTGATAACAAATATAG

21Lmma9205-23047

反向：TTCACATGACAGATATACACTT

正向：TTCTTTAGACTAAGAGCACATT

22LmmalO155-21050

反向：AGTTACAGATCTTCTCCAATT

正向：ATTATTTACCCTACAGAGTGC

23Lmmall240-41049

反向：GTATTATCGGTAATGTCTTCAT

正向：AAAGAATAGCATTTAATTAAGGA

24Lmmal2210-25047

反向：GTAAGTATCGCTGTTTGTTATT

正向：CACAGCTCAATAAACTCTATG

25Lmmal3180-23047

反向：CATTATCCCTAATCTAATCATC

正向：AACTACTGTGGCTGACATAT

26Lmmal5220-27050

反向：CTGATTAACATAATGACCATCT

正向：ATAGATTCATATCTTCTTGCAT

27Lmmal6220-25050

反向：TATAAATTATCATCTTCACTGC

正向：CCACGAATATCAACTGCTGCC

28AY942818125-15055

反向：TCTGACACTGCTCTTCCACC

正向：AAACGAGGAAACAGAGCAC

29AY94281990-14053

反向：CAAGTACCTGCTGCAACTAG

正向：AGGTCTTTTATCTTCGGCCC

30AY942820170-23053

反向：AMCGAAAAAGCAGCCCA

正向：TGTAGTCTCTGTTTGCTTC

31AY942821280-41049

反向：TTCTGTGTCGTCAAACTC

正向：AGAATAAAGGGGACACCAGAC

32AY94282323055

反向：CCATCATCGCCCACTCAG

正向：TTGATGCAACTTTCTGCC

33AY942824220-32050

反向：ATGTGATTGTTAGAATGAACTT

正向：CGAGGAAGAGGAAGATTATGAC

34AY942825240-39053

反向：CGAATACCATCCAGCAAAATAC

正向：TGTGAAATGGAAGGTTGAG

35AY94282624050

反向：ACAGCAATCGTTGCATTC

正向：GTTTTCATTCTCAAAATGTGTG

36AY942827180-24049

反向：CTTTCATGTTCATAGATGCAA

正向：CTCGCATTTCTCGCAGTC

37AY942828130-29053

反向：TCCCTCCATTTAACCCTCC

正向：GAACGAGAAATCGGGAAC

38AY942829370-50050

反向：GCAGCCATTGAATACAGAG

（一）广西益谱检测技术有限公司

表2聚丙烯酰胺凝胶电泳所用的6个品种芒果与19对引物

芒果品种

序号引物名称序号引物名称

名称

桂热芒

1AY94281811AY942828

07-3号

桂热芒290

2AY94282312Lmmal

号

3金煌芒AY94281913Lmmal5

4圣心AY94282014Lmmal3

5台农AY94282115Lmma9

6桂七AY94282716Lmmal1

7AY94282917Lmmal2

8AY94282418Lmma4

9AY94282519Lmma5

10AY942826

表3聚丙烯酰胺凝胶电泳所用的20个品种与19对引物

序号芒果品种名称引物名称

1桂热芒07-2号mangoES39

2桂热芒07-3号mangoES40

3桂热芒08-10号mangoES126

4桂热芒10-1号mangoES170

5桂热芒16-1号mangoES69

6桂热芒285号Lmma7

7桂热芒290号LmmalO

8三年芒MCR55

9PULMERmangoES24

10安宁红芒mangoES35

11金煌芒mangoES71

12桂热芒10号mangoES172

13圣心MCR130

14桂热芒82号Lmma6

15桂热芒60号Lmma8

16桂热芒4号EST14

17泰国芒14号MCR220

18桂热芒08-6号Lmmal6

19台农mangoES11

20桂七

（二）广西作物遗传改良生物技术重点开放实验室和南宁国拓生物科技有限公

司

表4聚丙烯酰胺凝胶电泳所用的6个品种与38对引物

芒果品种

序号引物名称序号引物名称

名称

桂热芒

1AY94281820mangoES11

07-3号

桂热芒290

2AY94282321mangoES24

号

3金煌芒AY94281922mangoES35

4圣心AY94282023mangoES39

5台农AY94282124mangoES40

6桂七AY94282725mangoES69

7AY94282926mangoES71

8AY94282427mangoES126

9AY94282528mangoES170

10AY94282629mangoES172

11AY94282830EST14

12Lmmal31MCR220

13Lmmal532MCR55

14Lmmal333MCR130

15Lmma934Lmma6

16Lmmal135Lmma7

17Lmmal236Lmma8

18Lmma437Lmmal0

19Lmma538Lmmal6

一、毛细管电泳

广西益谱检测技术有限公司、广西作物遗传改良生物技术重点开放实验室、

南宁国拓生物科技有限公司均选择6个芒果品种，6对引物，每个品种分别做6

对引物的毛细管电泳，品种名称及引物名称如下表6：

表5毛细管电泳验证所用的6个芒果品种与6对引物

序号芒果品种名称引物名称

1桂热芒07-3号mangoES39

2桂热芒290号mangoES126

3金煌芒mangoES172

4圣心Lmmal6

5台农AY942819

6桂七AY942820

2.6操作步骤

2.6.1样品采集

用不锈钢剪刀采集种植的已知品种的芒果嫩叶放入塑料样品袋中，做好标识，放入0-8℃保温箱中，

带回实验室，于T8℃冰箱中保存备用。

2.6.2DNA的提取

取2.6.1中适量芒果叶片用自来水冲洗干净，再用去离子水冲洗两遍，自然晾干后用不锈钢剪刀剪碎

放入研钵中，加入液氮研磨成粉末状，分取lOOmg放入1.5mL离心管中，加入750|JLCTAB提取溶液，

涡旋振荡混匀后于65℃水浴45min~60min,期间每隔15min颠倒离心管混匀；加入500pL的三氯甲烷，

颠倒混匀，12000rpm离心3min,转移上清液约0.5mL至新离心管中，加入等体积即0.5mL预冷至约4℃

的无水乙醇，颠倒混匀，-18℃冰箱下静置lh,12000rpm离心3min,去上清，室温下干燥沉淀。加入

50）JL无菌纯水于-18℃中保存备用。

注：以上为推荐的DNA提取方法。其他能够达到PCR扩增质量要求的DNA提取方法也适用于本规程。

2.6.3PCR扩增

PCR反应体系

PCR反应体系见表7。

表6PCR反应体系

试剂终浓度体积

灭菌纯水-8.5|JL

2xTaqTaqPlusPCR预混试剂1X12.5pL

10pmol/L正向引物0.4pmol/L1.OpL

10pmol/L反向引物0.4pmol/L1.0|jL

25ng/pLDNA模板2.Ong/pL2.0|iL

总体积25.OpL

2.63.2PCR反应程序

94℃预变性5min；94℃变性30s,退火30s（退火温度见表1推荐引物表），72℃延伸30s,35个循环;

最后72℃下延伸7min。

2.6.4PCR产物检测

非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测

.1聚丙烯酰胺凝胶制备

在一对玻璃板间插入1.0mm宽的间隔片，在封口处注入1%琼脂糖溶液，让其凝固密封。在50mL量杯

中依次力口入7.5mL5xTBE缓冲液，7.5mL40%Acryl/BisSolution（29:1）,搅拌并用纯净水定容至30mL；加

入200HL10%过硫酸钱和12HL四甲基乙二胺溶液，混匀后倒入凝胶板之间，随即插好样品梳，使其在

50min~60min内聚合凝固，凝胶高度应不小于10cm。

.2电泳

将玻璃板固定于垂直电泳槽上，在电泳槽中加入电泳缓冲液，小心拔下样品梳。用加样器吸取WL不

同引物（表1）PCR产物，加入样品孔中，同时在同一块胶中加入1）JLDNAmarker。电泳选用的电压梯度

为卜5V/cm,2xTaqPlus预混试剂的蓝色指示带从上到下分别到达胶板1/2、2/3处（大约lh）后结束电泳。

.3银染显色

将附着凝胶的玻璃板用去离子水冲洗30s~60s后，将凝胶放入方形不锈钢盘中，加入染色液覆盖凝胶,

轻摇5min~10min进行染色；倒掉染色液，用去离子水快速漂洗，放入显色液中，轻摇至显色出清晰带纹:

取出凝胶用去离子水冲洗两遍，沥干后进行拍照。

2.6A.2毛细管电泳检测

.1PCR产物样品准备

分别取等体积的稀释后不同引物（表5）PCR扩增产物溶液混合，从混合液中吸取WL按序号加入到

DNA分析仪专用96孔板孔中，板中各孔分别再加入O.IRLDNALIZ500分子量内标和8.9pL去离子甲酰胺。

将样品在PCR仪上95℃变性5min,取出，迅速置于碎冰块上，冷去fJ10-15min。将整个96孔板置于离心机中，

离心10s后放置到DNA分析仪上待检。

2.6A.2.2电泳检测

按照仪器操作规程，编辑样品表及运行程序，执行运行程序，仪器自动给出检测结果，保存并记录

数据。

2.7数据记录与统计

样品每个SSR位点的等位变异采用扩增片段长度的形式表示。对于毛细管电泳检测方法，通过使用对

照品种，消除同型号不同批次间或不同型号DNA分析仪间可能存在的系统误差，使用片段分析软件读取

待检样品在该位点的等位变异。对于非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测方法，将每个扩增位点的等位变异

与相应的对照品种的等位变异片段大小进行比较，确定待检样品在该位点的等位变异。

纯点结合的等位变异大小数据记为X/X,其中X为该位点等位变异的大小；杂合位点的等位变异大小

数据记录为X/Y,其中X、Y分别为该位点上的2个等位变异的大小，小片段数据在前、大片段数据在后。

缺失位点在等位变异大小数据记录为0/0。

示例1：样品在某个位点上仅出现1个等位变异，大小为160bp,则该位点的等位变异数据记录为

160/160-

示例2：样品在某个位点上仅出现2个等位变异，大小为160bp、165bp,则该位点的等位变异数据记

录为160/165。

2.8判定方法

当待检样品和对照品种间差异位点数22,则判定为“不同品种,"；当待检样品和对照品种间差异

位点数=1,判定为“近似品种”：当样品间差异位点数=0,判定为“极近似品种或相同品种”。

2.9结果与记录

2.9.1用琼脂糖凝胶检测毛细管电泳和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果见附件原始记录图谱。

广西益谱检测技术有限公司结果原始记录图谱（见附件1）

广西作物遗传改良生物技术重点开放实验室结果原始记录图谱（见附件2）

南宁国拓生物科技有限公司结果原始记录图谱（见附件3）

四、制定标准的原则和依据，与现行法律、法规的关系，与有关国家标准、行业标准的协调

情况。

本标准的编制依据现行的法律、法规和国家强制性标准，与这些文件中的规定不存在矛盾，协调一

致。

五、重大意见分歧的处理结果和依据

无

六、提出标准强制实施或推荐实施的建议和理由

本项标准的制订，已经实验室的验证，可作为推荐性地方标准，用于芒果种质资源真伪的检测。

广西地方标准《芒果品种鉴定技术规程SSR分子标记法》编写组