第6章 代谢控制分析

Chapter6

EnzymeKineticsMetabolicControlAnalysis代谢通量分析可以找到需要优化的途径（通量），而如何快速有效地实现对目的途径（通量）的优化呢？需要知道途径中各单个反应速率变化对目标通量的影响程度，显然改造那些具有较大影响程度的反应的效果最好。Metaboliccontrolanalysisisamethodforanalysinghowthecontroloffluxesandintermediateconcentrationsinametabolicpathwayisdistributedamongthedifferentenzymesthatconstitutethepathway.

EnzymekineticsMetabolicControlAnalysis6.1酶动力学单底物的酶催化反应动力学模型:由V.C.R.Henri于1902年及L.Michaelis和M.L.Menten于1913年建立的。简单的酶催化反应动力学通常是指Michaelis-Menten动力学或饱和动力学。E+SESE+P两个假定：1.形成ES复合物的反应速度很快.2.第二步的逆反应速率可忽略。此假设仅在反应初期产物的累积量很少时才能成立。（快速平衡假设）

1925年Briggs及Haldane在快速平衡假设基础上做了改进：拟稳态假设,此假设在反应初期不成立，经过短暂过渡期后（ms)成立（P193,note6.1）。（1）米氏方程的推导快速平衡假设拟稳态假设E+SESE+PKm’:即ES的解离常数,单位浓度下复合物解离速度与形成速度之比Km:单位浓度下复合物总解离速度与形成速度之比Kcat=Vm/[E0]=k2

Kcat/Km

[S]<<Km时，[S]>>Km时，[S]=Km时，参数的确定：双倒数作图法产物浓度很低时，即米氏方程I=0I>0竞争性抑制的最终作用结果是使，因此降低了反应速度。最大反应速度不变。竞争性抑制可通过提高底物浓度来克服。(2)Competitiveinhibitionenzymekinetics(3)Non-competitiveinhibitionenzymekinetics非竞争性抑制剂不是底物类似物。抑制剂与酶结合的位点不是酶的活性位点，这种结合降低了酶的有效浓度。高底物浓度不能克服非竞争性抑制。必须加入其它试剂去阻止抑制剂与酶的结合。I=0I>0(4)Uncompetitiveinhibitionenzymekinetics反竞争性抑制剂只与ES复合物结合，而且它与酶无亲和作用。Vm值的降低要比Km值的降低更具显著作用，其最终结果是使反应速率降低。I=0I>0(5)Substrateinhibitionenzymekinetics如果底物自身有抑制作用：一种反竞争抑制，1/v是1/s的双曲函数，该双曲函数具有一垂直和一倾斜渐近线在低底物浓度时，[S]2/KSI<<1，观察不到抑制作用。反应速率为

在高底物浓度时，K’m/[S]<<1，抑制作用显著。这种情况下反应速率为

P199Example6.1产物是抑制剂的非竞争产物抑制最适底物的判断：（P204的推导）三个动力学参数的确定：通过上图得到四条回归直线在X轴上截距，求得Km(四个数据的平均值）通过下图回归直线与Y轴截距得到Km/Vm，进而求出Vm，进而通过斜率求出KI变构酶的特点具有协同作用的酶——变构酶一般具有多个调节位点（效应物）与催化位点（底物）。它们大多是几个亚基聚集而成的多聚体酶，具有四级结构，这些亚基可以不同，也可以完全相同。动力学特征：S型曲线，而不是米氏方程的双曲线协同性(Cooperativity)(6)Cooperativityandallostericenzyme与一个底物分子的结合引起酶结构的改变，导致剩余结合位点对底物亲和力的升高，随着更多的底物结合，亲和力也越高，称为正协同效应。底物既是反应物，又是调节分子。即底物自身的浓度充当酶活的调节信号，可以在一个较小的底物浓度变化范围内引起酶活的快速、急剧的升高。有利于细胞针对生理环境变化采取快速的调控。双曲线表明：M-M动力学方程中r对s的敏感性不高，除非在底物浓度接近零时S型曲线表明：r对s的敏感性在底物浓度接近零时不高，而在正常底物浓度下十分敏感协同性使变构酶在胞内代谢物处于生理浓度附近（S=Km)起着反应“开关”的作用，对于细胞实现对反应和代谢物浓度的快速调节具有重要意义。变构酶的动力学方程：Hill经验方程底物同酶的结合具有协同性时，n>1。slpoe=nlns参数n和K的确定:P205:例6.2噻唑篮（MTT)法测定胞内NADH浓度两种底物MTT0X及乙醇过量，反应中可以认为浓度不变

ADH快速将NAD+还原为NADH，反应体系中NADH浓度稳定不变

d[MTTred]/dt=k[MTT0X][NADH]做标准曲线（图6.7），测定MTTred生成速度后在标准曲线上确定对应的[NADH]

HK,PFK-1,andpyruvate

kinase(PYK)aretherate-limitingstepsbecause:Theyaretheslowestenzymesinthepathwaybyatleastoneorderofmagnitude(theyhavethelowestVmaxvalues).TheyareallostericenzymesInconsequence,tovarytheglycolyticflux,oneoftheseenzymeshastobemodified.GAPDHPGKENOPGAM6.2代谢控制分析EMP途径通量控制分散，需要多个酶一起扩增控制分析需要解决的问题：修饰哪些酶？酶活改变多少？（1）基本概念与定理通量J反应速率r

稳态时，一条途径的J等于这条途径中任何一步反应的r

线性途径中最好的情况是：某步反应速率r提高a%,达到新的稳态后，这条途径的其它所有反应速率r均提高a%，从而流经该反应的通量也提高a%

最差的情况是：某步反应速率r提高a%,达到新的稳态时，其它所有反应速率均不变化，该步反应速率恢复到原水平，流经该反应的通量不能提高。更一般的情况是：某步反应速率r提高a%,达到新的稳态时，其它所有反应速率均提高了b%，该步反应速率从提高a%降至提高b%，流经该反应的通量提高b%。一般性原则：如何对这种影响程度实行量化？通量控制系数（FCCs)

由代谢途径中一个酶活的无穷小变化所引起的通量的相对变化与该酶活的相对变化之比。通量控制系数（Fluxcontrolcoefficients)Channellingeffect

Channellingreferstomechanismsinwhichtheproductofoneenzymeistransferreddirectlytoanenzymethatusesitassubstratewithoutnecessarilypassingthroughthefreesolution.Onlyindependentcatalysts:酶活=酶浓度Manyenzyme-catalysedreactionratesarelinearintermsoftheenzymeconcentration(atleastinacertainrangeofenzymeconcentrations),controlcoefficientscanbewrittenusingenzymeconcentrations通量控制系数的加和定理

summationtheorem在线性途径中酶促反应的通量控制系数的和为1：Thesummationsareoverallthestepsofthesystem.Thismayincludenotonlythestepsofthepathwayofinterestbutalsoofotherpathways(aslongastherearelinksbetweenthem).Inprincipleforawholecell,thesummationwouldhavetobeoverallmetabolicstepsofthatcell.Giersch,C.(1988)Controlanalysisofmetabolicnetworks.1.Homogeneousfunctionsandthesummationtheoremsforcontrolcoefficients.Eur.J.Biochem.174,509-513.9浓度控制系数

Concentration-controlCoefficients同样地，途径中某个酶活的变化也会影响到胞内代谢物的浓度，这种影响程度用浓度控制系数来量化：I个反应，I-1个胞内代谢物这些系数说明了当第i个酶活性无穷小变化所引起的第j个中间代谢物浓度的相对变化与酶活相对变化之比。浓度控制系数

Concentration-controlCoefficients浓度控制系数的加和定理所有酶按同样的程度a改变时（见注释6.3），中间产物浓度保持不变：这表明对每个中间产物，至少有一个酶施加负控制，即当该酶的浓度增加时代谢物浓度却下降了Asaconsequenceofthesummationtheorems,oneconcludesthatthecontrolcoefficientsareglobalpropertiesandthatinmetabolicsystems,controlisasystemicproperty,dependentonallofitselements(steps).同样地，代谢物浓度的变化对途径中的某些反应速率也有影响，这种影响程度用弹性系数来描述：代谢物j对于第i个酶的弹性系数可定义为：弹性系数Elasticitycofficients第i个反应速率对于第j个代谢物浓度的弹性：在假定其它系统变量保持不变的条件下，由代谢物浓度的无穷小变化所引起的反应速率相对变化与代谢物浓度相对变化之比负的弹性系数表明当第j个中间产物浓度增加时第i个反应速率降低，反之亦然。如果第j个中间产物不影响第i个酶反应的反应速率（此反应的速率可能与sj的浓度无关或酶被饱和），那么Unlikecontrolcoefficients,elasticitycoefficientsarenotsystemicpropertiesbutrathermeasurehowisolatedenzymesaresensitivetochangesinparameters.（反应速率只和底物、产物、调节物这三类代谢物有关）AparticularlyusefulandimportantfeatureofMCAisthatitcanrelatethekineticpropertiesoftheindividualreactions(localproperties)with(global)propertiesofthewholeintactpathway.Thisisdonethroughtheconnectivitytheoremsthatrelatethecontrolcoefficientsandtheelasticitycoefficientsofstepswithcommonintermediatemetabolites

Kacser,H.&Burns,J.A.(1973)Thecontrolofflux.Symp.Soc.Exp.Biol.27,65-104.Connectivitytheorem通量－控制的连接定理

Flux-controlconnectivitytheorem

P215证明具有低的通量控制系数的反应具有高弹性系数反之，具有高的通量控制系数的反应具有低弹性系数因为：具有高通量控制系数的反应的速率变化将使其它所有反应速率（具有低的通量控制系数）也发生较大的变化，而这种变化是由代谢浓度的变化传递的。所以其它反应对代谢物浓度变化一定比较敏感，即具有较高的弹性系数。相反，具有低通量控制系数的反应的速率变化也将引起代谢物浓度变化，但代谢物浓度变化不能使其它反应发生较大的变化浓度－控制的连接定理

Concentration-controlconnectivitytheorem利用矩阵符号，可以将（6.34）、（6.36）、（6.38）、（6.39）、（6.40）中所有的法则概括为：I个反应，I-1个胞内代谢物下标j、k表示代谢物，i表示反应加和连接通量浓度I-1个等式（I-1）2-（I-1)个等式（I-1）I个I个I(I-1)个代谢物1代谢物2代谢物I-1代谢物1代谢物2代谢物I-1此时I为单位阵（维数I×I）。对于非奇异阵E，控制系数为：例6.3由弹性系数求通量控制系数(P216)由式6－41得：由于知道动力学方程后求弹性系数比较容易，所以可以方便地通过弹性系数得到通量控制系数C1J是x的减函数，P217,Figure6.96.28例6－4代谢控制分析举例4个反应，3个胞内代谢物FCCsr1r2r3r4S1S2S3中间产物s3浓度的增加将阻碍第二步反应（s1转化为s2）因此增加处于反馈控制的酶E2的浓度的方法并不是提高通量的最佳方法

FCCsr1r2r3r4S1S2S3从浓度控制系数可以看出：当最后一个酶的活性提高时，最后一个中间产物s3及第一个中间产物s1的浓度迅速降低然而同时第二个中间产物s2的浓度增加

在引入FCCs的概念之前，一个调节酶经常意味着一个限速步骤，但在引入FCCs的概念后发现这并不是实情。MCA理论表明限速步骤这一概念是毫无道理的，取而代之的应是FCCs值和限速程度！

如果反馈抑制能被解除，即

32＝0，则可计算出控制系数矩阵：

S1S2S3r1r2r3r4此时速率控制步骤现在为酶促反应中的第二个酶。因此它为潜在的速率控制酶，即：如果抑制被去除或大量减少时，第二个反应将控制总体通量当反馈抑制去除后，最后一行的所有三个浓度系数成为负值。增加最后一个酶的活性将降低所有中间产物的浓度。上游代谢物（底物）为负值，下游代谢物（产物）为正值假设构建一个新菌株，该菌株拥有一与E2相似的酶但是弹性系数不同。第二步酶促反应的弹性系数为：s3的反馈抑制减小并且变小。具有细微差别E2的生产菌株代替了原始菌株，控制系数矩阵变为：采用新酶后最后一个酶的通量控制能力减少，每种酶的通量控制系数都接近平均值0.25。通量控制分散，因此没有酶在酶促反应的通量控制中占优势上面的讨论没有包括操作条件对细胞特性的影响，需要注意的是通量控制系数可能随着操作条件的变化发生巨大变化当对具有大的通量控制系数的反应（酶）进行操作后，通量控制系数的值大小变得差不多，但是这并不一定表明经由途径的通量要比原始菌株的通量高很多。进一步改进需要继续增加途径中所有酶的剂量当知道s、p及动力学方程时，可通过计算得到所有胞内代谢物浓度。并计算出弹性系数（si的复杂函数），最后求出控制系数矩阵C(包括通量控制和浓度控制系数）在对酶进行修饰前（动力学参数的改变）必须最优化当前反应网络：通过模拟在不同s及p值下的通量实现通量最大化。胞内代谢物浓度的变化较小的原则（2）FCCs的确定方法直接法：通过对通量和酶活的测量来直接确定控制系数的值，活力的变化很小但并不是无穷小间接法：确定弹性系数的值，随后通过MCA定理计算得出控制系数瞬时代谢物浓度法大偏差理论：通过测量由酶活的大范围波动所导致的通量变化来计算FCCs的方法

linlogkineticsmethod直接法

在某一酶活处的FCC值等于曲线中该酶活处切线的斜率用相应的通量酶活比J/E归一化基因工程方法:构建大量的突变株，这些突变株中某个酶的表达量不同（或酶活不同），测定所有突变株在同一操作条件下的通量:得到J-E关系图滴定法：纯化酶提高酶活或专一性抑制剂降低酶活，检测产物或底物变化得到通量

1.Theperturbationsshouldbeverysmall-becausethesteadystatemoveswhentheperturbationsarefinite,thereisanerrorassociatedwithlargeperturbations(thelargertheyare,thebiggertheerror.Tominimizethiserrortheperturbationsshouldbesmall,somethinglike1%wouldbeideal.However,theeffectsofsmallperturbationsareusuallyalsosmallandsoareverydifficulttodetect.Moreoftenperturbationsofover10%areused,eventhoughtheyimplysomeerrorintheresults.2.Inhibitorsmustbespecific-ifwewanttoperturbtherateofonereactionbyaddinganinhibitor,thismustonlyaffectthatreactionalone,notanyoftheothersinthesystem.Itisoftendifficulttofulfilthisrequirement.3.Therateofreactionmustchangelinearlywiththeenzymeconcentration,ifwewanttousetheenzymeconcentrationastheparametertoperturb.Iftherelationbetweenrateandenzymeconcentrationisnotlinear,thentheresultingcontrolcoefficientswillnotconformtothesummationtheorems.Severalproblemsassociatedwiththeseapproaches:这种方法有两个重要的前提条件：代谢系统中的所有反应和有关的调节作用都被充分的描述系统处于稳态，初始底物和最后产物的浓度是定值为了确保这些条件得到满足，最好至少直接测定系统的一个控制系数来对结果进行检验。测定弹性系数的方法：

a.通过动力学模型计算弹性系数

胞内酶动力学是否正确描述了胞内酶的功能？大多数酶动力学的研究是基于对初始反应速度的测量，而此时反应产物并不存在，显然这并不代表胞内的真实情况胞内环境的复杂性，包括很多可能是效应物的代谢物，而体外实验可能会遗漏某些重要效应物。

间接法b.双调法此反应的速度依赖于式中所示化合物的浓度，即r=f(cA,cB)。在稳态下J=r

，因此有：测定稳态时两个代谢物的浓度和通量，然后引入很小的一个扰动，例如改变细胞外底物的浓度，来产生一组新的通量和代谢物浓度的测量值。通过用有穷差异来对上式的微分进行近似化，这个干扰实验就产生了一个方程。换一种干扰，例如改变产物浓度产生了第二个方程。两个干扰实验就可以求得两个弹性系数。两组干扰产生的数据不能线性相关！干扰实验的数目取决于函数f!如果知道其中一个弹性系数，则另一个可通过单调节实验获得这种方法的优点是可以应用几个同类型的但调节幅度不同的调节，并且可用作图法来确定方程中的微分部分

c.单调法d.Top-down：自上向下法在许多情况下，并不需要知道所有的FCCs值，最重要的是知道那些（个）反应具有最大的控制系数分割代谢途径，通过双调法实验或单调法实验确定组弹性系数，求出GroupFCCs重新分割，直到找到对通量实行主要控制的反应或反应组反应组之间只能通过X发生相互作用！大偏差理论Largedeviations注意到斜率ΔJ/ΔE与原始点处的dJ/dE不同，因此用ΔJ/ΔE来代替dJ/dE计算通量控制系数就会导致错误的结果e:酶活Ki:常数双曲线关系式E’大偏差理论是一种强有力的分析工具，它将MCA的无穷小的限制扩展到可测量的实验领域。但是该强调的是:前面公式的推导是通过一个经过简化的一级动力学的近似表达式来实现的。所以用这些公式来分析一个具有高度非线性特点的系统就可能导致不确定的结果通量控制系数估算表达式的推导

例：鼠肝细胞中的色氨酸代谢基态：无诱导物时扰动后状态：有诱导物

通过激素诱导，色氨酸2，3-加双氧酶的活性（vmax）从基本态的13.7升至101μmol(gDWh)­-1,通量由基本态的2.6升至7.8μmol(gDWh)­-1

代谢主要包括两步：细胞吸收色氨酸和色氨酸2，3-加双氧酶分解色氨酸基态：扰动后的诱导状态：大偏差法能同时确定扰动前、后两个状态的通量控制系数大偏差理论的基础E为酶活，R为比例因子（a）ci<<Kmi,；cj<<Kmj,,ks≈1（b）当所观察的酶活变化并没有引起底物对酶的饱和度的大幅变化时。对于任一酶来说，当其它酶活不变时如果所有的其它酶活保持不变，上式可以产生一个象图示那样形状的通量——酶活关系曲线，这证实了简化的动力学表达式符合基本的准则瞬时代谢物浓度法这种方法的应用有四个假定：

1.外部代谢物库对代谢途径的动力学没有影响，或它们的浓度被控制在一个稳态水平。这也是一个MCA的普遍假定。

2.稳态条件下酶动力学的线性近似在一个较宽的代谢物浓度范围内是有效的。

3.在理论上必须可以通过对代谢物浓度的测量来确定流经途径中每一反应的瞬时通量。

4.代谢物在体系中均匀分布（另一个MCA的普遍假定）P22